ЛИПИДЫ УМЕРЕННО ГАЛОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ СОЛЕНОГО ОЗЕРА РЕГИОНА АРАЛЬСКОГО МОРЯ

АННОТАЦИЯ

Установлено содержание и состав свободных и связанных липидов умеренно галофильных бактерий, выделенных из соленой воды региона Аральского моря. В состав группы связанных липидов входили нейтральные липиды (1,35%), гликолипиды (0,11%) и фосфолипиды (0,015%).

ABSTRACT

The contents and compositions of free and bound lipids from moderately halophilic bacteria isolated from saline water of Aral Sea region were established. The bound lipids group composition included neutral lipids (1,35%), glycolipids (0,11%), and phospholipids (0,015%).

Ключевые слова: Аральское море, умеренно галофильная бактерия, нейтральные липиды, гликолипиды, фосфолипиды, жирные кислоты

Keywords: Aral Sea, moderately halophilic bacterium, neutral lipids, glycolipids, phospholipids, fatty acids

Введение

Род Halovibrio был впервые предложен Фендрихом [1], а типовой штамм Halovibrio variabilis был объединен с штаммом DSM 3050^T. На данный момент зарегистрировано только 2 вида; другой типовой штамм Halovibrio denitrificans DSM 15503^T [2]. Род Halovibrio характеризуется как вибрионы или короткие спириллы, грамотрицательные, и оба типа штаммов были выделены из гиперсоленых озер. Биологическая очистка сточных вод при чрезвычайно высокой концентрации соли, особенно нефтехимической и других отраслей промышленности, является важной мерой [2].

Гиперсоленые озера в районе Аральского моря с высокой минерализацией (50-400 г/л) снижают свой уровень из-за испарения или полностью высыхают летом и распространяют соль на окружающие территории. Биота, населяющая Аральское море, прошла через последовательность и непрерывную адаптацию к возрастающему засолению, но до сих пор микробное разнообразие не изучено. Микробное сообщество гиперсоленых экосистем особенно охарактеризовано с точки зрения состава зеленых водорослей и фауны [3, 4], но об их бактериальных и архейных сообществах известно меньше [5, 6, 7]. Таким образом, гиперсоленая среда остается неуловимым резервуаром микроорганизмов, потенциально способных производить новые биоактивные соединения и промышленно ценные молекулы.

Целью настоящего исследования было охарактеризовать содержание и состав липидов умеренно галофильных бактерий из региона Аральского моря.

Материалы и методы исследования

В работе был использован штамм бактерии Halovibrio variabilis UzAS3 – продуцент экзополисахаридов, депонированный под номером СКБ-355 коллекции микроорганизмов Института микробиологии АН РУз [8].

Для культивирования галофильных бактерий использовали жидкую среду следующего состава (г/л): NaCl – 156,0; MgCl₂·6H₂O – 13,0; MgSO₄·7H₂0 – 20,0; CaCl₂·6H₂0 – 1,0; KCl – 4,0; NaHCO₃ – 0,2; NaBr – 0,5 и KH₂PO₄ – 0,5; NH₄Cl – 2,0; FeCl₃·6H₂O – 0,005; глюкоза – 10,0; дрожжевой экстракт – 10,0 (pH 7,2) [9]. Культивирование галофильных бактерий в периодическом процессе проводили в термостате при 35-37ºС (Memmert, Германия) в колбах Эрленмейера объемом 1 л, содержащих 500 мл питательной среды и далее непрерывно встряхивая (160 об/мин). Из жидкой культуры на стационарной фазе роста клетки осаждали центрифугированием (РС-6, Россия) при 4400 об/мин в течение 20 мин.

Нейтральные липиды экстрагировали из измельченной биомассы путем пропитывания гексаном. Биомассы после извлечения нейтральные липиды сушили на воздухе, а затем смесью хлороформа с метанолом (2:1) по методу Фольча [10] из нее экстрагировали концентрат полярных липидов, состоящий из остатков нейтральных липидов, гликолипидов и фосфолипидов. Неочищенный экстракт полярных липидов обрабатывали 0,05% водным раствором CaCl₂ для удаления нелипидных компонентов, хлороформную фазу отделяли на делительной воронке, хлороформ из экстракта удаляли отгонкой на роторном испарителе с последующим высушиванием образца в сушильном шкафу при температуре 60ºС до постоянного веса. Затем полярные липиды фракционировали методом колоночной хроматографии на силикагеле на отдельные группы липидов, при этом нейтральные липиды элюировали хлороформом, гликолипиды - ацетоном, а фосфолипиды - метанолом. Выход липидных групп установлен гравиметрически. Жирные кислоты выделяли из продуктов щелочного гидролиза ацилсодержащих липидов [11].

Для выделения из липидов суммы жирных кислот и подготовки их к газохроматографическому анализу, навеску образца поместили в круглодонную колбу на 50 мл, добавили 20 мл 2N раствора КОН в метаноле и колбу поместили на водяную баню. Омыление липидов вели при кипячении в течение 1 часа. Полученные мыла разлагали 50%-ным водным раствором H₂SO₄. Серную кислоту добавляли до появления розовой окраски раствора по метилоранжу. Из полученного кислого раствора жирные кислоты экстрагировали трижды диэтиловым эфиром по 20-30 мл. Объединенные эфирные вытяжки промывали дистиллированной водой до нейтральной среды по метилоранжу, сушили над безводным сульфатом натрия, затем эфир отгоняли на роторном испарителе в вакууме водоструйного насоса. Жирные кислоты переводили в метиловые эфиры путем обработки свежеприготовленным диазометаном.

Очистку полученных метиловых эфиров ЖК (МЭЖК) проводили методом препаративной тонкослойной хроматографии на пластинках с силикагелем в системе растворителей гексан:диэтиловый эфир (4:1) два раза. Зону МЭЖК на сорбенте проявили в парах I_2, счищали с пластинки и десорбировали с силикагеля многократным элюированием хлороформом. Хлороформные элюаты объединяли, и хлороформ упаривали на роторном испарителе. Полученные МЭЖК растворяли в гексане и анализировали на газожидкостном хроматографе.

Для анализа использовали газожидкостной хроматограф (ГХ) марки Agilent Technologies 6890N с пламенно-ионизационным детектором, капиллярной колонки (30 м × 0,32 мм) с нанесенной фазой НР-5, газом-носителем He (гелий) и при температуре от 150 до 270ºС [12].

Определение содержания каротиноидов в нейтральных липидах. К навеске нейтральных липидов в мерной колбе на 25 мл добавили гексан до метки, затем взяли 5 мл этого раствора и поместили в другую мерную колбу вместимостью 25 мл, довели раствор гексаном до 25 мл и анализировали на ФЭКе при длине волны 440 нм. Приготовили стандартный раствор бихромата калия. Массовую долю каротиноидов (Х, мг%) в пересчете на β-каротин рассчитали по формуле:

,

где:

0,00208 – количество β-каротина, соответствующее цвету 1 мл стандартного раствора образца бихромата калия; D₀ – оптическая плотность раствора стандартного образца; D₁ - оптическая плотность испытуемого раствора; 50 – разведение, см³; а – навеска, г.

Результаты исследования и их обсуждение

В наших экспериментах в образце, определено содержание следующих ненасыщенных кислот: пальмитолеиновая, олеиновая и линоленовая, линолевая и эйкозеновая. В используемых условиях ГХ олеиновая кислота не отделяется от линоленовой. Поэтому приведено суммарное процентное содержание. Кроме этого, определено содержание следующих насыщенных кислот: каприновая, лауриновая, миристиновая, пальмитиновая, стеариновая, нонадециловая и арахиновая.

Из образца было выделено 1,46 % общих липидов. Содержание нейтральных липидов, гликолипидов и фосфолипидов составило, соответственно: 1,35%, 0,10 % и 0,015% от массы образца. Нейтральные липиды имели ярко желтую окраску, которая объяснялась наличием каротиноидов. В нейтральных липидах содержится 35,9 мг% или 0,0359% каротиноидов. Состав и содержание жирных кислот представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Состав жирных кислот (в виде метиловых эфиров) нейтральных липидов (НЛ), гликолипидов (ГЛ) и фосфолипидов (ФЛ) образца, % от массы кислот

*Эта пара жирных кислот в использованных условиях ГХ не разделяется и выходит одним пиком

В результате установили, что биомасса умеренно галофильных бактерий содержат 1,46% общих липидов, в общих липидах содержит 35,9 мг% или 0,0359% каротиноидов. Экспериментально определены жирнокислотный состав нейтральных липидов, гликолипидов и фосфолипидов. В составе ЖК липидов умеренно галофильных бактерий идентифицировали 14 компонентов с преобладанием насыщенной пальмитиновой кислоты (43,31%) и суммы омега-9-олеиновой и омега-3-линоленовой кислот (33,58%).

Список литературы:

1. Fendrich C. Halovibrio variabilis gen. nov. sp. nov., Pseudomonas halophila sp. nov. and a new halophilic coccoid eubacterium from Great Salt Lake, Utah, USA. Syst. Appl. Microbiol., 1988, vol. 11, pp. 36-43.
2. Sorokin D.Y., Tourova T.P., Galinski E.A., Belloch C. and Tindall B.J. Extremely halophilic denitrifying bacteria from hypersaline inland lakes, Halovibrio denitrificans sp. nov. and Halospina denitrificans gen. nov., sp. nov., and evidence that the genus name Halovibrio Fendrich 1989 with the type species Halovibrio variabilis should be associated with DSM 3050. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2006, vol. 56, pp. 379-388.
3. Aladin N.V., Micklin P. and Plotnikov I. Biodiversity of the Aral Sea and its importance to the possible ways of rehabilitating and conserving its Remnant water bodies. Environmental problems of Central Asia and their economic, security and social impacts. Qi J. and Evered K.T., Eds., Dordrecht: Springer, 2008, pp. 73-98.
4. Zhitina L.S. Phytoplankton of the Large Aral Sea in June 2008, Oceanology, 2011, vol. 51, pp. 1004-1011.
5. Aripov T.F., Kukanova S.I., Zaynitdinova L.I. and Tashpulatov J.J. Microorganisms of the extreme zones of the southern Aral Sea region. Biotechnol. Ind. J., 2016, vol. 12, pp. 1-7.
6. Alexyuk M., Bogoyavlenskiy A., Alexyuk P., Moldakhanov Y., Berezin V. and Digel I. Epipelagic microbiome of the Small Aral Sea: Metagenomic structure and ecological diversity. MicrobiologyOpen, 2020, vol. 10, e1142.
7. Shurigin V., Hakobyan A., Panosyan H., Egamberdieva D., Davranov K. and Birkeland N.K. A glimpse of the prokaryotic diversity of the Large Aral Sea reveals novel extremophilic bacterial and archaeal groups. MicrobiologyOpen, 2019, vol. 8, e00850. https://doi.org/10.1002/mbo3.850
8. Kulonov A.I., Mirzarakhmetova D.T. and Turaeva N. Оbtaining of bacterial polysaccharides. J. Chem. Chem. Eng. 2020,vol. 4, pp. 63-67.
9. Melanie S., Winterburn J.B. and Devianto H. Production of Biopolymer Polyhydroxyalkanoates (PHA) by Extreme Halophilic Marine Archaea Haloferax mediterranei in Medium with Varying Phosphorus Concentration. J. Eng. Technol. Sci. 2018, vol. 50, pp. 255-271.
10. Folch I., Less M., Stanley H.S. J. Biol. Chem. 1957, 226, 447.
11. Ulchenko N.T., Bekker N.P., Glushenkova A.I. Chem. Nat. Compd. 2000, 36, 572.
12. Ulchenko N.T. Chem. Nat. Compd. 2013, 48, 1067.