СКРИНИНГ УСТОЙЧИВЫХ К ИОНАМ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

АННОТАЦИЯ

Из загрязненных тяжелыми металлами почв были выделены более 30 чистых изолятов микроорганизмов. Было определена резистентность изолятов к различным концентрациям ионов меди и кобальта. Как показывают результаты исследования, на 14 сутки культивирования при повышенной концентрации ионов меди в составе культуральной среды  превышающей ПДК в 10 раз (118,0 мг/л)  наиболее высокую резистентность показали 6 изолятов, а при 10 ПДК ионов кобальта (238,0 мг/л) – 4. Следует отметить, что самыми жизнеспособными изолятами как при 5- и 10 ПДК как по ионам меди, так и по ионам кобальта оказались 3 изолята. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о высоком уровне резистентности микроорганизмов к ионам тяжелых металлов, изолированных из загрязненных почв химических предприятий.

ABSTRACT

More than 30 pure cultures of microorganisms were isolated from soils contaminated with heavy metals. The resistance of the isolates to different concentrations of copper and cobalt ions was determined. The results of the experience showed that the highest resistance was observed by 6 isolates on the 14th day of cultivation to the highest concentration of copper ions. As the results of the study show, on the 14th day of cultivation, at an increased concentration of copper ions in the composition of the culture medium in MPC-10  (118.0 mg / l) 6 isolates showed the highest resistance and in MPC-10 of cobalt ions (238.0 mg / l) - 4. It should be noted that in MPC-5 and 10 of copper and cobalt ions too were the most viable 3 isolates. Thus, the results obtained show that microorganisms isolated from contaminated soils of chemical plants have a high resistance to heavy metal ions.

Ключевые слова: загрязненные почвы, тяжелые металлы, скрининг микроорганизмов, кобальт, медь, резистентность, оптическая плотность.

Keywords: contaminated soils, heavy metals, screening of microorganisms, cobalt, copper, resistance, optical density.

Введение

Загрязнение почв тяжелыми металлами (ТМ) является одной из актуальных проблем экологии из-за повышенного выброса металлов в окружающую среду. Состав таких загрязнителей чрезвычайно разнообразен, он изменяется в процессе появления новых производств и усовершенствования, существующих [1, 2]. Способы удаления ТМ из окружающей среды можно разделить на две группы: 1) биотические методы, в основе которых лежит накопление ТМ растениями или микроорганизмами и 2) абиотические методы, в основе которых лежат такие физико-химические процессы, как осаждение, адсорбция и т.д. [2-4]. Однако физико-химические процессы являются очень дорогостоящими и не дают окончательного решения. Биологические методы считаются рентабельными и экологически безопасными. Известно несколько механизмов устойчивости бактерий к ионам ТМ: внеклеточный барьер, активный транспорт ионов металлов из клетки, внеклеточное связывание, внутриклеточное связывание и восстановление ионов металлов [4]. Иммобилизация может быть результатом сорбции на биомассе или экзополимерах, транспорта и внутриклеточного связывания или осаждения в виде органических и неорганических соединений, например оксалатов и сульфидов. Кроме того, восстановление соединений с более высокой валентностью может влиять на мобилизацию, например, Mn (IV) в Mn (II), или иммобилизацию, например, Cr (VI) в Cr (III). В то же время, повышенные концентрации ТМ могут образовывать токсичные комплексные соединения, сильно влияющие на биологические функции, поэтому получение микроорганизмов, способных расти и активно функционировать при высоких концентрациях тяжелых металлов представляет большой интерес для их использования в процессах биоремедиации. Основной механизм ремедиации с использованием устойчивых микроорганизмов заключается в биоаккумуляции или биосорбции металлов, при этом ионы металлов адсорбируются на клеточной поверхности различными путями [5-12].

Исходя из вышесказанного целью данной работы является скрининг микроорганизмов резистентных к различным концентрациям меди и кобальта, изолированных из почвенных образцов, загрязненных тяжелыми металлами.

Материалы и методы исследования

Объекты и образцы исследования. Объектом исследования являются почвенные образцы недействующего аэродрома, расположенного в Ташкентской области, а также Самаркандского и Кашкадарьинского химических заводов. Из образцов почв были выделены в чистую культуру более 30 изолятов бактерий и актиномицетов.

Выделение чистых культур микроорганизмов из почвенных образцов. Для выделения микроорганизмов переносили навеску (1 г) исследуемой почвы в колбы с 10 мл стерильной жидкой питательной пептонной среды (ПС) и среды Гаузе  (для выделения культур актиномицетов) и встряхивали на шейкере в течение 30 мин при комнатной температуре и 160 об/мин, после чего из полученной суспензии готовили десятикратные разведения до  10^-6 кл/мл. По 0,1 мл из разведений 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6 переносили в чашки Петри на поверхность мясопептонного или пептонного агара (ПА), а также на агаризованную среду Гаузе и Чапека, инкубировали в термостате при 28-30°С в течение 5 суток. Однотипные колонии принимали за колонии одного микробного вида и отсевали в чистую культуру для дальнейшего исследования.

Культивирование микроорганизмов. Все выделенные изоляты микроорганизмов изучали на устойчивость к ионам меди и кобальта при концентрации 11,8 мг/л; 59,0 мг/л; 118,0 мг/л и 23,8 мг/л; 119,2 мг/л; 238,0 мг/л, соответственно. Приведенные концентрации ТМ превышает ПДК данных металлов в 2, 5 и 10 раз, соответственно. В качестве солей тяжелых металлов использовали CuSO₄×5H₂O и CoSO₄×7H₂O. Выбор этих металлов обусловлен их высокой токсичностью и сочетанием всех известных механизмов подавления жизнедеятельности микроорганизмов [13, 14].

Резистентность изолятов определяли при их культивировании на стандартной жидкой ПС состава, г/л: L-глюкоза–20; K₂HPO₄ – 0,5; MgSO₄×7H₂O – 0,5; NaCl – 0,5; пептон – 10.

Актиномицеты культивировали на среде Гаузе, г/л:вода водопроводная – 1,0; крахмал растворимый – 20,0; нитрат калия (KNO₃) – 1,0; гидроортофосфат калия (K₂HPO₄) – 0,5; магний сернокислый  (MgSO₄ ×7H₂O) – 0,5; хлорид натрия (NaCl) – 0,5; гептагидрат сульфата железа (II) (FeSO₄ × 7H₂O) – следы; рН 7,0-7,5; стерилизация при 0,5 атм. (121 ºС) – 15-20 мин.

Соли металлов в форме сульфатов растворяли в дистиллированной воде, стерилизовали на кипящей водяной бане в течение 10 мин и вносили в жидкую ПС и среду Гаузе после автоклавирования. Контролем служила ПС и среда Гаузе не содержащая ионов металла. В посевном материале присутствовало 10⁷КОЕ/мл микробных клеток. Культуры выращивали при 28-30,0±0,2 ºС, в течение 14 суток.

Морфологические признаки микроорганизмов изучали у молодых (24-часовых) и 3-5-суточных культур. Родовую принадлежность выделенных микроорганизмов устанавливали на основании морфолого-культуральных и физиолого-биохимических свойств, используя "Определитель бактерий Берджи" [15], а также «Методы оценки бактериального разнообразия почв и идентификации почвенных бактерий», «Практикум по микробиологии» [16, 17]. 

Оптическую плотность (ОП₅₉₀) культур определяли на спектрофотометре V-5100 (Китай). Учет результатов проводили в 1, 3, 5 и 14 сутки культивирования в присутствии различных концентраций меди и кобальта, сравнивая плотность культур в опытных и контрольных вариантах. Количественный учёт микроорганизмов проводили прямым подсчётом под микроскопом.

Результаты и их обсуждение

Как известно  в настоящее время полностью отказаться от тяжелых металлов практически невозможно, поэтому они продолжают всесторонне использоваться во многих сферах промышленности, являясь глобальными загрязнителями планеты. В связи с этим, содержание тяжелых металлов в компонентах окружающей среды строго нормируется. Разработаны предельно допустимые концентрации (ПДК), соблюдение которых является обязательным и при сопоставлении с которыми определяется коэффициент опасности предприятия, размер его санитарно-защитной зоны.

В наших исследованиях из загрязненных почв исследуемых объектов были выделены более 30 чистых культур микроорганизмов. Была определена  резистентность данных культур к различным концентрациям ионов меди и кобальта. Следует отметить, что ПДК меди для почв составляет 3,0 мг/кг, а кобальта 5,0 мг/кг.

Рост микроорганизмов наблюдался во всех вариантах концентраций солей тяжелых металлов в питательной среде на протяжении всего периода культивирования, следовательно, добавление этих солей в указанных концентрациях не оказало летального действия на изолированные чистые культуры микроорганизмов. Результаты определения ОП микроорганизмов в процессе культивирования под воздействием различных концентраций солей тяжелых металлов меди и кобальта приведены в таблицах 1 и 2.

Согласно табл. 1 на 5 сутки культивирования чистых изолятов микроорганизмов в присутствии ионов тяжелых металлов Си²⁺ и Co²⁺ превышающих ПДК в 2 раза среднеустойчивыми были изоляты: №№11, 14, 23, 25, 26, 27 и №№1, 2, 10, 12, 13,  соответственно. При ПДК –5 и 10 среднюю резистентность к ионам Си²⁺ показали изоляты №№1,2, 4, 10, 14, 25,26 и №№1, 10, 14, 25, 26, соответственно. Другие исследуемые изоляты показали слабую устойчивость в течение 5 суток культивирования в присутствии различных концентраций меди в составе питательной среды. Следует отметить, что при ПДК-5 и ПДК-10 кобальта средний рост и развитие показывают изоляты №1 и 11. При ПДК-5 ионов Co²⁺ наиболее хорошую биомассу накапливает изолят №3 (табл.1).

Таблица 1.

Резистентность микроорганизмов к ионам меди и кобальта в течение 5 сут культивирования

Примечание: + - слабый рост, ++ - средний рост, +++ - хороший рост.

Известно, что медь (Cu²⁺) играет значительную роль в некоторых физиологических процессах микроорганизмов в малых концентрациях: фотосинтезе, дыхании, перераспределения углеводов, метаболизме протеинов, восстановлении и фиксации азота. Кроме этого, медь оказывает влияние и на механизмы, определяющие устойчивость растений к заболеваниям [18-22].

Как показывают результаты исследования, приведенные в таблице 2, на 14 сутки культивирования при ПДК-10 ионов меди среди исследуемых 28 изолятов наиболее высокую резистентность показали 6 изолятов :№№14, 18, 20, 21, 22 и 23, а 11 исследуемых изолятов показали среднюю резистентность.   При ПДК-10 ионов кобальта наиболее устойчивыми были изоляты №№ 10, 11, 15 и 17. В данных условиях среднюю резистентность к ионам кобальта показывают 3 изолята (табл.2). Следует отметить, что самыми жизнеспособными изолятами как при ПДК-5 и 10 Си²⁺_, так и при ПДК-5 и 10 Co²⁺ оказались изоляты №№ 10, 11 и 15.

Как известно, тяжёлые металлы оказывают пагубное воздействие на микроорганизмы, а их токсичность зависит от биодоступности тяжелого металла и поглощенной дозы [23, 24].

Полученные результаты свидетельствуют о высоком уровне резистентности микроорганизмов, изолированных из загрязненных почв химических предприятий, к ионам тяжелых металлов (табл. 1, 2).  Отобраны 8 наиболее устойчивых к различным концентрациям ионов меди и кобальта изоляты микроорганизмов: №№ 20, 21, 22, 28  и 10, 11, 15, 17 соответственно (рис. 1, 2). В наших исследованиях  рост и развитие исследуемых изолятов показали, что они по-разному адаптируются к различным концентрациям ионов меди и кобальта в питательной среде. То есть было установлено, что некоторые из отобранных  изолятов устойчивы к различным концентрациям ионов меди, другие - ионов кобальта. Это связано с тем, что некоторые микробы обладают более высокой чувствительностью к определенному тяжелому металлу. Микробиологические процессы в почве могут либо солюбилизировать металлы (т.е. повышать их биодоступность и потенциальную токсичность), либо иммобилизовать их (т.е. уменьшать биодоступность металлов). Эти процессы биотрансформации являются важными компонентами биогеохимических циклов металлов, используемых для биоремедиации образцов, загрязненных тяжелыми металлами [25-27]. Как видно из рисунка 1и 2, при повышении ПДК кобальта и меди в 10 раз изоляты №№10, 11, 15, 17 и  20, 21, 22, 28 образуют наибольшую

Таблица 2.

Резистентность микроорганизмов к ионам меди и кобальта в течение 14 сут культивирования

Примечание: + - слабый рост, ++ - средний рост, +++ - хороший рост.

биомассу по отношению к контролю. Следовательно, в контрольном варианте ОП₅₉₀ изолятов №15 и 28 составляет 0,270 и 0,566 опт. ед., а при десятикратном повышении ПДК кобальта и меди в культуральной среде – 2,170 и 2,148 опт. ед. Как известно, биоаккумуляция включает поглощение тяжелых металлов живой биомассой бактерий, грибов и микроводорослей и характеризуется поглощением загрязняющих веществ живой биомассой клетки [28-31].

Рисунок 1. Наиболее эффективные микроорганизмы резистентные к ионам кобальта в течение 14 сут культивирования

Рисунок 2. Наиболее эффективные микроорганизмы резистентные к ионам меди в течение 14 сут культивирования

Далее, было установлено таксономическое положение отобранных эффективных изолятов резистентных микроорганизмов к ионам ТМ кобальта и меди на основе морфолого-культуральных и некоторых физиолого-биохимических свойств:

• изоляты №№ 10, 11, 15, 20 –  прямые, подвижные грамотрицательные палочки с перетрихиально расположенными жгутиками, не образуют спор, на плотных питательных средах образуют слизистые, выпуклые колонии с неровными краями, 3-4 мм в диаметре, размер клеток в длину 2-3 мкм, замедленно разжижают желатин, ферментируют глюкозу, маннит, не ферментируют лактозу, сахарозу;
• изоляты №17, 21, 22  – прямые, подвижные грамположительные палочки c перитрихиально расположенными жгутиками,  диаметром около 05-06 мкм и длиной 4-5 мкм, образуют споры, на плотных питательных средах образуют серовато-белые бугристые колонии с неровными краями, вязкой консистенции с диаметром колоний 5-7 мм, ферментируют глюкозу, сахарозу маннит, не ферментируют лактозу и мальтозу, гидролизуют крахмал и казеин;
• изолят №28 – образует не имеющий перегородок мицелий с тонкими нитями диаметром 0,4—1,8 мкм, длиной 2,5-3,0 мкм, окрашивается по Граму положительно, имеет цепочки, состоящие из нескольких неподвижных спор на воздушном мицелии.

На основе полученных результатов отобранные эффективные изоляты микроорганизмов резистентных к ионам кобальта и меди отнесены к следующим родам: Enterobacter sp. 10, Enterobacter sp. 11, Enterobacter sp. 15, Bacillus sp. 17 и Enterobacter sp. 20, Bacillus sp. 21, Bacillus sp. 22, Streptomyces sp. 28, соответственно. Полученные результаты согласуется с тем, что в исследованиях Suraya et al., (2013); Bojоrquez et al., (2019);  Abioye et al., (2018); Tarekegn et al., (2020)  выявлено, что штаммы E.cloacae, B.subtilis, B.megaterium, Bacillus sp. показывают наиболее высокую резистентность к ионам Pb²⁺, Cu²⁺, Cd²⁺, Hg²⁺ и Сr⁶⁺ [32-35].

Таким образом, устойчивость к ионам тяжелых металлов относится к ключевым свойствам бактерий, которые будут применяться в биоремедиации тяжелых металлов. В будущем наиболее устойчивые местные штаммы микроорганизмов к ионам ТМ будут основой препаратов предназначенных для биоремедиации загрязнённых ионами меди и кобальта почв.

Список литературы:

1. Tar Jennifer L. Wood, Wuxing Liu, Caixian Tang, Ashley E. Franks. Microorganisms in heavy metal bioremediation: strategies for applying microbial-community engineering to remediate soils [J]. AIMS Bioengineering, 2016, 3(2): 211-229.
2. Микробиологическая ремедиация природных систем от тяжелых металлов: учеб.-метод. пособие / Т.В. Багаева, Н.Э. Ионова, Г.В. Надеева. – Казань: Казанский университет, 2013. – 56 с.
3. Gupta A., Joia J., Sood A., Sood R., Sidhu C., Kaur G. Microbes as potential tool for remediation of heavy metals: a review. J MicrobBiochem Technology. 2016;8(4):364–372.
4. Choudhury R., Srivastava S. Zinc resistance mechanisms in bacteria. Curr. Sci. 2001. V.81. №7. P.768–775.
5. Lloyd, J.R. Bioremediation of metals; the application of micro-organisms that make and break minerals. Microbiol. Today 2002, 29, 67–69.
6. Kapoor A., Viraraghvan T. Fungal biosorption—An alternative treatment option for heavy metal bearing wastewater: A review. Bioresour Technol. 1995;53(3):195–206.
7. Gadd GM. Bioremedial potential of microbial mechanisms of metal mobilization and immobilization. Curr Opin Biotechnol. 2000;11(3):271–279.
8. Lin CC, Lin HL. Remediation of soil contaminated with the heavy metal (Cd2⁺) J Hazard Mater. 2005;122(1–2):7–15.
9. Neboh H.A., Ilusanya O.A., Ezekoye C.C., Orji F.A. Assessment of Ijebu-Igbo Abattoir effluent and its impact on the ecology of the receiving soil and river. J Environ Sci Toxicol Food Technol. 2013;7(5):61–67.
10. Fauziah S.H., Jayanthi B., Emenike C.U., Agamuthu C. Remediation of heavy metal contaminated soil using potential microbes isolated from a closed disposal site. Int J BiosciBiochemBioinform. 2017;7(4):230–237.
11. Ali H, Khan E, Ilahi I. Environmental chemistry and ecotoxicology of hazardous heavy metals: environmental persistence, toxicity, and bioaccumulation. Journal of Chemistry , Volume 2019, pp 1-14.
12. Cervantes C., Campos-Garcıa J., Devars, S., Gutierrez-Corona F., Loza-Tavera H., et al.  Interactions of chromium with microorganisms and plants. FEMS Microbiology Reviews. 2001. 25(3): 335–347.
13. Johri N, Jacquillet G, Unwin R (2010) Heavy metal poisoning: the effects of cadmium on the kidney. Biometals 23: 783-792.
14. Theron A.J., Tintinger G.R., Anderson R. Harmful Interactions of Non-Essential Heavy Metals with Cells of the Innate Immune System. J. Clinic Toxicol. 2012.S3:005.
15. Bergey’s manual determinative bacteriology. Eds.Holt J.A. et al. Baltimore: Williams and Wilkins, 1994. 787 p.
16. Лысак Л.В., Добровольская Т.Г., Скворцова И.Н. Методы оценки бактериального разнообразия почв и идентификации почвенных бактерий.  М: Макс пресс. 2003. 120 с.
17. Практикум по микробиологии: Учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений /А. И. Нетрусов [и др.]. – М.: Издательский центр «Академия», 2005. – 604 с.
18. Turpeinen R., Kairesalo T., Haggblom M., “Microbial activity community structure in arsenic, chromium and copper contaminated soils,” Journal of Environmental Microbiology, 2002, vol. 35, no. 6, pp. 998–1002.
19. Siddiquee S., Rovina K., Azad S. A. “Heavy metal contaminants removal from wastewater using the potential filamentous fungi biomass: a review,” Journal of Microbial and Biochemical Technology, vol. 07, no. 06, pp. 384–393, 2015.
20. Lakherwal D. “Adsorption of heavy metals: a review,” International Journal of Environmental Research Development, vol. 4, pp. 41–48, 2014.
21. Ahsan N., Lee D. G., Lee S. H., Kang K. Y., Lee J. J., Kim P. J., et al. Excess copper induced physiological and proteomic changes in germinating rice seeds. Chemosphere 67, 2007. Р. 1182–1193.
22. Richard A., Festa and Dennis J. Thiele Copper: An essential metal in biology.Current Biology Vol 21 No 21 2011, Pages R877-R883
23. Igiri B., Okoduwa S., Idoko G., Akabuogu E., Adeyi et al. Toxicity and Bioremediation of Heavy Metals Contaminated Ecosystem from Tannery Wastewater: A Review. Journal of Toxicology 2018: 1-16.
24. Rasmussen L.D., Sоrensen S.J., Turner. R., Barkay T. Application of a mer-lux biosensor for estimating bioavailable mercury in soil. Soil Biology & Biochemistry, Vol. 32, No. 5, 2000, p. 639-646.
25. Gauthier P.T., Norwood P., Prepas E.E., Pyle G.G. Metal-PAH mixtures in the aquatic environment: A review of co-toxic mechanisms leading to more-than-additive outcomes. Aquatic Toxicology. 2014. 154:253-269.
26. Chen S., Yin H., Ye J., Peng H., Liu Z. et al.  Influence of co-existed benzopyrene and copper on the cellular characteristics of Stenotrophomonas maltophiliaduring biodegradation and transformation. Bioresource Technology. 2014. 158:181–187.
27. Olaniran O., Balgobind A., Pillay B. Bioavailability of heavy metals in soil: Impact on microbial biodegradation of organic compounds and possible improvement strategies. International Journal of Molecular Sciences. 2013. 14(5): 10197–10228.
28. Ndeddy R.J., Aka and Babalola O.O. Effect of bacterial inoculation of strains of pseudomonas aeruginosa, alcaligenes feacalis and bacillus subtilis on germination, growth and heavy metal (Cd, Cr, and Ni) uptake of  brassica juncea.  International Journal of Phytoremediation, 2016. Vol. 18, no. 2, p. 200–209.
29. Akcil A., Erust C., Ozdemiroglu S., Fonti V., and Beolchini F., “A review of approaches and techniques used in aquatic contaminated sediments: metal removal and stabilization by chemical and biotechnological processes,” Journal of Cleaner Production, 2015. Vol. 86, pp. 24–26.
30. Abbas H.S., Ismail M.I., Mostafa M.T., and Sulaymon H.A. Biosorption of heavy metals: A review. Journal of Chemical Science and Technology, 2014.Vol. 3, pp. 74–102.
31. Paliwal V., Puranik S., Purohit H.J. Integrated perspective for efective bioremediation. Appl BiochemBiotechnol. 2012;166 (4):903-24.
32. Klaus-Joerger T., Joerger R., Olsson E., Granqvist C. Bacteria as workers in the living factory: metal-accumulating bacteria and their potential for materials science. Trends Biotechnol. 2001; 19(1):15-20.
33. Carolina Bojórquez, Martín Gabriel Gabriel Frías-Espericueta, Bruno Gómez-Giland Domenico Voltolina. Biosorption of cadmium and lead using suspended and immobilized Enterobacter cloacae at different pH. Rev. Int. Contam. Ambie. 2019, 35 (1). Р.259-264.
34. Abioye O.P., Oyewole O.A., Oyeleke S.B., Adeyemi M.O., Orukotan A.A. Biosorption of lead, chromium and cadmium intannery effluent using indigenous microorganisms. Braz. J. Biol. Sci. 2018, 5. Р. 25–32.
35. Tarekegn M.M. Salilih F.Z. Ishetu A.I. Microbes used as a tool for bioremediation of heavy metal from the environment. Cog.Food Agric.2020, 6.