ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ СУПРАМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ НА ПРОЦЕССЫ ПЕРИКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ И АКТИВНОСТЬ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ КЛЕТОК СЕРДЕЧНОЙ МЫШЦЫ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ МИОКАРДИТЕ

АННОТАЦИЯ

В статье исследовано влияние супрамолекулярных комплексов, состоящих из глицирризиновой и ацетилсалициловой кислот (ГЛАС) и глицирризиновой кислоты и флавоноида рутин (ГК+Р) на процесс перикисного окисления липидов (ПОЛ) в гомогенате и мембранах митохондрий и на активность дыхательных ферментов- сукцинатоксидазы и ротенон чувствительной НАДН дегидрогеназы кардиомиоцитов крыс на модели экспериментального миокардита. Установлено, что при экспериментальном миокардите наблюдалась интенсификация ПОЛ в гомогенате и мембранах митохондрий, при этом наблюдается снижение активности изученных ферментов дыхательной цепи митохондрий. Семидневное введение миокардитным животным супрамолекулярных комплексов ГЛАС и ГК+Р приводило к нормализации процесса ПОЛ сердечной мышцы, а также восстановлению активности сукцинатоксидазы и НАДН дегидрогеназы. ГЛАС оказывал на изученные показатели более выраженное стимулирующее влияние.

ABSTRACT

The article investigates the effect of supramolecular complexes consisting of glycyrrhizic and acetylsalicylic acids (GLAS) and glycyrrhizic acid and the flavonoid rutin (GA + R) on the process of lipid peroxidation (LPO) in the homogenate and membranes of mitochondria and on the activity of respiratory oxidase enzymes - succinon-sensitive NADH dehydrogenase of rat cardiomyocytes in a model of experimental myocarditis. It was found that in experimental myocarditis, an intensification of lipid peroxidation was observed in the homogenate and mitochondrial membranes, while a decrease in the activity of the studied enzymes of the mitochondrial respiratory chain was observed. A seven-day administration of supramolecular complexes GLAS and + R to myocarditis animals led to the normalization of the LPO process of the heart muscle, as well as the restoration of the activity of succinate oxidase and NADH dehydrogenase. GLAS had a more pronounced stimulating effect on the studied indicators.

Ключевые слова: гомогенат, митохондрии, миокардит, ПОЛ, МДА, сукцинатоксидаза, НАДН дегидрогеназа, ГЛАС, ГК+Р

Keywords: homogenate, mitochondria, myocarditis, LPO, MDA, succinate oxidase, NADH dehydrogenase, GLAS, GA + R.

В настоящее время согласно сведениям ВОЗ болезни сердечно-сосудистой системы занимают в мире одно из ведущих мест.Сердечно-сосудистые заболевания возникают в результате нарушения обмена веществ и способствуют биохмическим изменениям в кардиомиоцитах [1]. В условиях диабетической кардиомиопатии, миокардитах, а также при стрептозотоциновом диабете обнаружено усиление оксидативного стресса и нарушение функционального состояния митохондрий скелетных и сердечных мускулов [2].В большинстве экспериментальных моделей дисфункции миокарда показано, что окисление свободных жирных кислот, активация фосфолипаз инарушение энергообмена миокарда представляют собой взаимосвязанные процессы, осуществляемые на уровне митохондрий [1,3].

Вместе с тем известно, что в основе развития многих патологий сердечной мышцы лежат процессы нарушения проницаемости ионных каналов, стимуляция перекисного окисления липидов, окисления тиоловых групп, и образования реактивных форм кислорода (ROS) [4,5]. При инфаркте миокарда увеличение количества жирных кислот стимулирует в митохондриях кардиомиоцитов ацетилкоэнзим А и служит причиной возрастания активных форм кислорода в дыхательной цепи. Увеличение свободных радикалов влияет на Н⁺-проводимость и изменяет митохондриальный мембранный потенциал Δψ_m, , в результате работа F₀F₁-АТФазы снижается [6].

В условиях сахарной ишемии регуляция малонил КоА карнитинпальмитоилтрансферазы и изменения в транспорте жирных кислот имеет важное значение [7]. При этом в группе экспериментальных животных на модели ишемии наблюдается возрастание активности миокардиодистрофии. В настоящее время возможность коррекции митохондриальных нарушений при экспериментальном миокардите исследуется в большинстве научных лабораторий мира. С этой точки  зрения поиск растительных веществ, обладающих антиоксидантной активностью и влияющих на  функциональное состояние митохондрий при различных заболеваниях сердечно сосудистой системы представляется важным и необходимым[8,9].

В последние годы в клинической практике применяются различные медицинские препараты, содержащие производные глицирризиновой кислоты, получаемой из корня солодки. В результате комплексообразования наблюдается стабильное снижение побочного токсического действия основного препарата и усиление его фармакологических свойств. Глицирризиновая кислота является растительным селективным ингибитором тромбина; снижает повышение сывороточного уровня маркерных ферментов (креатинфосфаткиназы, лактатдегидрогеназы, аспартатаминотрансферазы) в сыворотке крови; препятствует снижению содержания в миокарде гликогена и повышения содержания общих липидов, активации перекисного окисления липидов и снижению антиоксидантной активности сыворотки крови; улучшает электрокардиографические показатели, перспективна для применения при патологических процессах в сердце, сопровождающихся воспалительными и некротическими изменениями миокарда, в частности, при миокардитах и инфаркте миокарда [10].

В институте Биоорганической химии АН РУзбыл создан новый нестероидный противовоспалительный препарат ГЛАС, представляющий собой супрамолекулярный комплекс глицирризиновой кислоты с ацетилсалициловой кислотой. Предварительно показано, что этот препарат в малых дозах обладает выраженной антиагрегационной активностью. Синтезирован новый супрамолекулярный комплекс глицирризиновой кислоты и флавоноида рутина (ГК+Р).

Целью настоящего исследования явилось изучение кардиопротекторных свойств супрамолекулярных комплексов ГЛАС и ГК+Р на модели экспериментального миокардита.

Материал и методы исследования

Опыты проводили на беспородных крысах-самцах весом 180-200г. Модель экспериментального миокардита воспроизводили путем подкожного введения 0,1% адреналина гидрохлорида в дозе 0,3 мг/100г. веса тела крысы в течении 3х дней [11]. Все животные были распределены на 4 группы: 1-интактная; 2-контрольная, животные сэкспериментальныммиокардитом (ЭМ); 3-миокардит+ГЛАС в концентрации (2,5мг/кг); 4-миокардит+ГК+Р (30мг/кг). Митохондрии из клеток сердечной мышцы выделяли методом дифференциального центрифугирования в среде, содержащей (в млмолях: 250-сахарозу; 10-трис-HCl; ЭДТА-10 мМ, рН 7,4[12]. Перекисное окисление липидов (ПОЛ) определяли по методу [13].При определении содержания малонового диальдегида МДА использовали коэффициент молярной экстинции (ε=1,56^×10⁵ М^-1 см): нмоль МДА/мг белка=1.56×30.

Кроме того, для изучения процесса ПОЛ в мембране митохондрий использовали Fe²⁺/аскорбат систему. В результате действия этой системы митохондриальная мембрана теряет барьерную функцию, что приводит к увеличению объема органеллы и набуханию митохондрий. Изменение объема митохондрий определяется фотометрически. Состав инкубационной смеси (в мМ): КСI-125, трис-НСI-10, рН 7,4; Концентрации  в мкмолях [ мкМ]: FeSO₄ -10  аскорбат-600 ; количество митохондрий-0,5 мг/мл. Активность НАД.Н-оксидаз определяли полярографическим методом [14].Содержание белка определяли по методу Лоури в модификации Петерсона[ 15].

Результаты и их обсуждение

Известно, что многие биологически активные соединения растительной природы обладают высокой антиоксидантной активностью.В первой серии исследований мы определяли содержание вторичного продукта ПОЛ-МДА в гомогенатах клеток миокарда интактных и модельных крыс, а также при введении в организм миокардитных животных супрамолекулярных комплексов ГЛАС и ГК+Р. Данные представлены на рисунке 1. Было установлено, что содержание МДА в гомогенате миокарда интактных крыс составляет 2,75±0,25 мкмоль/г. При экспериментальном миокардите содержание вторичного продукта ПОЛ увеличивается на 95,3±8,30% и достигает 5,37±0,45 мкмоль/г, что свидетельствует об интенсификации процесса перикисного окисления в кардиомиоцитах миокардитных крыс.

Рисунок 1. Влияние супрамолекулярных комплексов ГЛАС и ГК+Р на содержание МДА гомогената интактных и миокардитных крыс.

(содержание МДА определяли при 540 нм оптической плотности, *Р<0,05; **Р<0,01; n=4).

Семидневное введение ГЛАС и комплекса ГК+Р миокардитным животным снижало содержание МДА до3,5±0,24 мкмоль/г и 4,2±0,37 мкмоль/г соответственно, что в процентном соотношении составляет 68,0±5,4% и 42,6±3,4%. Полученные в этих экспериментах результаты совпадают с известными в литературе данными по определению антиоксидантной активности в кардиомиоцитах веществ растительной природы [16].

После установления антиоксидантной активности изучаемых комплексов в следующей серии, в опытах in vivo исследовали перекисное окисление липидов, вызванное Fe²⁺+аскорбатом в мембране митохондрий  кардиомиоцитов. Данные представлены на рисунке 2. Из рисунка видно, в присутствии в инкубационной среде митохондрий Fe²⁺+аскорбата наблюдается резкая интенсификация процесса ПОЛ, что приводит к нарушению барьерных функций мембраны митохондрий и увеличению объема этих органелл. Согласно полученным данным при адреналиновом миокардите по сравнению с интактными животными набухание митохондрий возрастает в 7,2 раза. Использованные в качестве корригирующих средств ГЛАС и комплекс ГК+Р снижали набухание митохондрий, при этом действие ГЛАС оказалось более эффективным.

Рисунок 2. Влияние ГЛАС и комплекса ГК+Р на перикисное окисление липидов мембран митохондрий кардиомиоцитов во всех случаях Р<0,05; n=4).

Состав инкубационной среды в : КСI-125 мМ, трис-НСI-10мМ, рН 7,4; Концентрации в мкмоль : FeSO  –10 аскорбат-600 ; количество митохондрий 0,5 мг/мл; (* - Р < 0,05, ** - Р < 0,01, ***- Р< 0,001; n=5).

Основные механизмы появления активных форм кислорода (АФК) в организме связаны обычно с нарушениями функционирования электроннотранспортных цепей митохондрий, а также изменениями свойств дегидрогеназ. Обычно, примерно 98 % всего кислорода, поступающего в клетки, используется для окисления субстратов с образованием АТФ и выделением тепла, и лишь 2% используется в реакциях образования активных форм кислорода, которое значительно возрастает при усиленном поступлении кислорода в клетки или нарушении работы электроннотранспортной цепи митохондрий.

Рисунок 3. Влияние ГЛАС и комплекса [ГК+Р]а активность митохондриальной сукцинатоксидазы и ротенон чувствительной НАД.Н оксидазы(*Р<0,05;**Р<0,01; n=4).

Известно, что процессы ПОЛ и ферментативного липолиза играют ключевую роль в регуляции структурного состояния митохондриальных мембран, влияя на степень их сопряженности, мембранный потенциал и проницаемость для катионов [17]. Определяющее значение вышеназванные процессы имеют в повреждении митохондрий при патологии. Имеются сообщения о том, что при различных формах сердечной патологии, происходит переход циклоспорин А-чувствительной поры внутренних мембран митохондрий в открытое состояние и это, по мнению авторов, является существенной стадией повреждения митохондрий, ведущих к некрозу и/или апоптозу кардиомиоцитов [18].В связи с этим в последующих исследованиях мы определяли активности митохондриальных ферментов-сукцинатоксидазы и ротенон чувствительной НАД.Н – оксидазы при миокардите и лечении комплекспми ГЛАС и ГК+Р. Данные, представленные на рисунке 3 (А и Б) свидетельствуют о том, что при экспериментальном миокардите наблюдается существенное ингибирование активности изученных ферментов на 47,6±3,5 и 39,5±2,7% соответственно. Введение в организм миокардитных крыс комплексов ГЛАС и ГК+Р восстанавливало сниженную активность ферментов на 17,7±1,3%, 35±2,2% (рис.3 А) и 25±2,1%, 29,2±2,4% (рис.3 Б) соответственно. Из двух исследованных супрамолекулярных комплексов и в этом случае наиболее эффективным оказался ГЛАС.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что при эспериментальном миокардите происходит усиление процесса ПОЛ  как в гомогенате, так и в мембранах митохондрий кардиомиоцитов и сопровождается ингибированием активности ферментов дыхательной цепи митохондрий. Введение в организм таких животных супрамолекулярных комплексов ГЛАС и ГК+Р восстанавливало в различной степени нарушенные процессы ПОЛ и активность ферментов митохондрий. Более выраженным действием на изученные показатели обладал ГЛАС. Несмотря на то, что ГЛАС и ГК+Р обладают различной химической природой их действие на исследованные процессы оказалось положительным.

Список литературы:

1. Lopaschuk G.D., Ussher J.R., Folmes C.D.L. et al. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease // Physiol. Rev. – 2010. – V.90. – P. 207–258.
2. Егорова М.В., Афанасьев С.А., Попов С.В. Cостояние митохондрий и гипертрофия сердца при развитии стрептозотоцининдуцированного диабета на фоне экспериментального инфаркта // Сиб. мед. журн. – 2011. – Т.26, №10. –С.122–128.
3. Егорова М.В., Афанасьев С.А. Регуляторная роль свободных жирных кислот в поддержании мембранного гомеостаза митохондрий сердца при экспериментальной ишемии миокарда // Бюллетень сибирской медицины. – 2012. – № 3. – C.31-38. 
4. Barrera G., Gentile F., Pizzimenti S., Canuto R.A., Daga M., Arcaro A., Cetrangolo G.P., Lepore A., Ferretti C., Dianzani C., Muzio G. Mitochondrial dysfunction in cancer and neurodegenerative diseases: spotlight on fatty acid oxidation and lipoperoxidation products // Antioxidants. – 2016. – V.5(1). – P. 2-25.
5. Sada K., Nishikawa T., Kukidome D., Yoshinaga T., Kajihara N., Sonoda K., Senokuchi T., Motoshima H., Matsumura T., Araki E. Hyperglycemia induces cellular hypoxia through production of mitochondrial ros followed by suppression of aquaporin-1 // PLoS one. – 2016. – V.11(7). – P. 1-16.
6. Zuurbier C.J., Bertrand L., Beauloye C.R., Andreadou I., Meana M.R., Jespersen N.R., Alwar D.K., Prag H.A., Botker H.E., Dambrova M., Montessuit C., Kaambre T., Liepinsh E., Brookes P.S., Krieg T. Cardiac metabolism as a driver and therapeutic target of myocardial infarction // J Cell Mol Med. – 2020. – V.24:– P. 5937–5954.
7. Dyck J., Lopaschuk G. Malonyl CoA control of fatty acid oxidation in the ischemic heart // Jour. Mol. Cell. Card. – 2002. – V.34(9). – P. 1099-109.
8. Gibellini L., Bianchini E., De Biasi S., Nasi M., Cossarizza A., Pinti M. Natural compounds modulating mitochondrial functions // Evid Based Complement Alternat Med. – 2015. – V.2015. – P. 1-13.
9. Wood dos S.T., Cristina P.Q., Teixeira L.,Gambero A., Villena J.A., Ribeiro M.L. Effects of polyphenols on thermogenesis and mitochondrial biogenesis // Int J MolSci – 2018. – V.19(9). – P. 1-14
10. Толстиков Г.А., Балтина Л.А., Муринов Ю.И. Комплексы глицирризиновой кислоты с нестероидными противовоспалительными средствамикак новые транспортные формы // Хим.-фарм. журн. – 1991. – № 2. – С. 29–32.
11. Андреев С.В. Моделирование заболеаний – М. Медицина , 1973.- 236с.
12. Schneider W.C., Hogeboom G.H. Cytochemical studies of mammalion tissues: the isolation of cell components by differential centrifugation// Cancer. Res. – 1951. – V. 11(1). – P. 1-22.
13. Андреева Л.И, Кожемякин Л.А.,Кишкун А.А. – Модификация метода определения перикисей липидов в тесте с биобарбитуровой кислотой//Лаб.дело,- 1988,-№5.-с.41-43.
14. Рахимов М.М., Алматов К.Т. Некоторые особенности деградации полиферментных систем митохондрий печени крыс, подвергшихся тепловым воздействием//Биохимия.- Москва, 1977.-t.42.-b.10-C. 1852- 1862.
15. Peterson G.L. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable // Analytical biochemistry. – 1977. – 83(2). – P. 346-356.
16. El-MarasyS.A., El Awdan S.A., HassanA., Abdallah H.M. Cardioprotective effect of thymol against adrenaline-induced myocardial injury in rats // Heliyon. – 2020. – V.6.(7). – P. 1-8.
17. Чулиев И.Н., Камбурова B.C., Джураев А. 2(М-цитизин) этил-3-0-ацетил-18 3 Н-глицерретат как модификатор мегаканала митохондрий//ДАН РУз. - Ташкент, 2005.-№1.- С.41-47.
18. Brokmeier K.M., Pfeiffer D.R. Inhibition of the mitochondrial permeability transition by cyclosporine a during long time frome experiments: relationships between pore opening and activity of mitochondrial phospholipases // Biochemistry-1995.- v.34.-p. 16440-16449.