РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИНИДАЗОЛА В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ

АННОТАЦИЯ

Разработан и апробирован простой и экономичный УФ-спектрофотометрический метод количественной оценки тинидазола. Выбранная длина волны максимального поглощения λ_макс. для раствора тинидазола в фосфатном буфере (рН =6,86) составляет 317,3 нм. Калибровочный график показывает линейность на выбранной длине волны и подчиняется закону Ламберта-Бугера-Бира в диапазоне концентраций 3,0-30 мкг/мл с коэффициентом корреляции не ниже 0,992. Были проведены исследования извлечения тинидазола в фармпрепаратах, составляющий 97,9 – 100,4 %, что подтверждает точность предлагаемого метода. Метрологическая оценка разработанного спектрофотометрического метода показала хорошую воспроизводимость и точность определения тинидазола в моно- и многокомпонентной фармацевтической продукции различных фирм-производителей. Относительная ошибка определения тинидазола не превышает 2%. Статистическая обработка полученных данных показывает, что предлагаемый метод может быть успешно применен для рутинного анализа стабильности тинидазола в лабораториях контроля качества лекарственных средств.

ABSTRACT

A simple and economical UV spectrophotometric method for the quantitative assessment of tinidazole has been developed and tested. Selected wavelength of maximum absorption λ_max. for a solution of tinidazole in phosphate buffer (pH = 6.86) is 317.3 nm. The calibration graph shows linearity at the selected wavelength and obeys the Lambert-Bouguer-Beer law in the concentration range of 3.0-30 μg / ml with a correlation coefficient of at least 0.992. Studies have been conducted on the extraction of tinidazole in pharmaceuticals, which is 97.9 - 100.4%, which confirms the accuracy of the proposed method. The metrological evaluation of the developed spectrophotometric method showed good reproducibility and accuracy of the determination of tinidazole in mono- and multicomponent pharmaceutical products from various manufacturers. The relative error in the determination of tinidazole does not exceed 2%. Statistical processing of the data obtained shows that the proposed method can be successfully applied for routine analysis of the stability of tinidazole in laboratories for quality control of drugs.

Ключевые слова: тинидазол, спектрофотометрия, валидация, фармпрепараты.

Keywords: tinidazole, spectrophotometry, validation, pharmaceuticals

Введение

Тинидазол как средство для эффективного лечения протозойных инфекций известен уже на протяжении нескольких десятилетий [1].

Фармацевтическое действие тинидазола объясняется тем, что нитрогруппа, входящая в его молекулу, восстанавливается клеточными экстрактами микроорганизмов, например, трихомонад [2]. Образующийся при этом свободный нитрорадикал, может быть ответственен за антипротозойную активность препарата. В ряде работ также было показано, что химически восстановленный тинидазол высвобождает нитриты и вызывает повреждение очищенной бактериальной ДНК in vitro или ингибирует синтез ДНК в микроорганизме [3].

5-нитроимидазол является важным классом препаратов на основе имидазола и представляют собой хорошо зарекомендовавшую себя группу простейших и бактерицидных агентов [4].

Осознание важности тинидазола обусловливается и тем, что многие применяемые в современной медицинской практике препараты содержат этот компонент и другие производные нитроимидазола, таких как метронидазол, тинидазол, орнидазол, секнидазол и ронидазол. Препараты, содержащие эти компоненты, хорошо зарекомендовали себя в лечении серьезных инфекций, вызванных анаэробными бактериями и простейшими [5]: Trichomonas vaginalis, Entamoeba histolytica и Lamblia instestinalis.

Тинидазол также показал бактерицидное действие относительно анаэробных бактерий: Bacteroides fragilis, Bacteroides melaninogenicus, Bacteroides spp., Clostridium spp., Eubacterium spp., Fusobacterium spp., Peptococcus spp., Peptostreptococcus spp. и Veillonella spp.

Такое широкое применение тинидазола и его производных в лекарственных препаратах требует систематического контроля качества лекарственных средств и постоянного повышения эффективности имеющихся методов анализа.

Фармацевтическими статьями [6,7] предписывается количественное определение тинидазола и его производных ацидометрическим титрованием в среде ледяной уксусной кислоты [8] и адаптированные спектофотометри-ческие методы [9-13]. Однако эти методы имеют ряд недостатков, таких как трудоемкость, длительность выполнения, недостаточная селективность, применение токсичных органических растворителей, дорогостоящих реактивов и приборов [14-18]. При этом большая вариабильность условий выполнения методик нормативных документов, которые отличаются друг от друга, требует наличия в лаборатории большого ассортимента реактивов [19-21]. Это экономически нецелесообразно, и создает дополнительные трудности при воспроизведении данных методик анализа.

Вышеприведенные доводы свидетельствует о том, что проблема совершенствования существующих и разработка новых методов анализа тинидазола является актуальной.

Целью данной работы является разработка простой методики количественного определения тинидазола в лекарственных препаратах спектрофотометрическим методом и его валидация с использованием различных параметров.

Материалы и методы

Все химикаты и органические растворители имели квалификацию «хч» и «чда». Во всех экспериментах использовалась бидистиллированная вода, полученная в стеклянном бидистилляторе БС-6.

Товарный тинидазол (99,87%) был получен от Merc. Таблетки фармпрепаратов, содержащих тинидазол с заявленным содержанием 500 мг, приобретены через сеть аптек. Растворителем служил метанол для хроматографии. Разбавителем служил фосфатный буфер с рН 6,86, приготовленный из соответствующего фиксанала.

Электронные спектры регистрировали на спектрофотометре СФ-2000 в кварцевых кюветах 1 см на фоне растворителя. Значение рН контролировали с помощью универсального иономера И-130 с использованием стеклянного электрода ЭСЛ -63-07 и хлоридсеребрянного электрода сравнения ЭСЛ1-М3.

Стандартный раствор тинидазола с концентрацией 0,3 мг/мл получали растворением точной навески 15 мг тинидазола в 50 мл метилового спирта.

Калибровочные растворы готовили разбавлением исходного стандартного раствора, для чего 1 мл стандартного раствора помещали в мерную колбу на 20 мл и доводили до метки фосфатным буфером.

Холостую пробу готовили соответствующим разведением метанола фосфатным буфером.

Раствор тинидазола с концентрацией (0,015 мг/мл) сканировали в области длин волн 200-400 нм для определения λ _макс. поглощающей способности.

С целью определения оптимального рН сравнивали величину оптической плотности рабочих растворов с одинаковыми концентрациями тинидазола с различными значениями рН в диапазоне 2 – 10, измеренной при λ _{317 нм.}

 Для определения лекарственной формы тинидазола был применен разработанный и валидированный спектрофотометрический метод. Была проведена оценка содержания тинидазола в таблетках с заявленным содержанием тинидазола в дозе 500 мг. Для этого 10 таблеток были измельчены в порошок, откуда отбиралась навеска 500 мг препарата, которую растворяли в 50 мл метилового спирта. Для ускорения процесса растворения суспензию обрабатывали ультразвуком 40 кГц в течение 10 мин, фильтровали и 1,0 мл отбирали в мерную колбу объемом 20 мл и заполняли до метки буферным раствором. Получали раствор тинидазола с конечной концентрацией 0,015 мг/мл. Поглощение раствора образца регистрировали при определенном λ_max.

Аналогично проводили анализ таблеток, содержащих 500 мг тинидазола различных фирм-производителей.

Результаты и обсуждение

Структурная формула молекулы тинидазола приводится на рис. 1.

Рисунок 1. Структурная формула молекулы тинидазола

Как уже отмечалось, нитрогруппа, входящая в молекулу тинидазола, восстанавливается клеточными экстрактами микроорганизмов, и образующийся нитрорадикал обусловливает антипротозойную активность препарата.

В работе [22] было показано, что тинидазол обладает способностью поглощать в ультрафиолетовом свете, поэтому были изучены спектральные характеристики данного лекарственного вещества в области от 200 до 400 нм.

На рис. 2 приводится спектр поглощения раствора тинидазола в диапазоне 200-400 нм.

Рисунок 2. Спектр тинидазола в растворе метилового спирта в диапазоне 200-400 нм

Максимальная длина волны поглощения для тинидазола составила 317,3 нм, что позволило использовать более простую аппаратуру типа фотоколориметра КФК-3.

Изучение влияния рН на характер спектра раствора тимидазола проводили в диапазоне 2 - 10. Были получены значения максимума поглощения тинидазола, в кислой среде, вплоть до рН 3,56, которые характеризуются двумя максимумами при 208±1 нм и 278±1 нм. Дальнейшее увеличение рН приводит к батохромному смещению максимумов c одновременным гиперхромным эффектом.  

Дальнейшее увеличение рН раствора, превышающее значение 6,8 -7,2 приводит к гипсохромному смещению более длинноволнового максимума на 4-6 нм. Результаты этого исследования хорошо согласуются с данными , полученными другими исследователями [22-25].

На рисунке 3 приводится зависимость абсорбционного максимума от величины рН, из которого следует, что оптимальным является рН несколько более 6, а затем наблюдается явное снижение. Поэтому нами за оптимальное значение рН для спектрофотометрического определения тинидазола было принято 6,86, что соответствует значению стандартных образцовых растворов для калибровки рН-метров.

Рисунок 3. Влияние рН на светопоглощение раствора тинидазола

Предлагаемый метод был подтвержден в соответствии с руководящими принципами гармонизации параметров: селективность, линейность градуировочного графика, точность, надежность, предел обнаружения (LOD) и верхний предел количественного определения (LOQ) [26].

Было установлено, что УФ-спектр тинидазола воспроизводится при значении λ_max = 317,3 нм, с сохранением положения максимума поглощения в присутствии других веществ, традиционно входящих в состав лекарственных препаратов в качестве наполнителя: лактозу, сахар или крахмал [27].

Калибровочная кривая была получена путем построения графика зависимости светопоглощения от концентрации раствора лекарственного средства. Уравнение регрессии калибровочной кривой оказалось равным

y = 37,180 x + 0,018

Калибровочная кривая показана на рисунке 4 и представлена в таблице 1.

Рисунок 4. Калибровочный график для тинидазола

Таблица 1.

Метрологические параметры спектрофотометрического определения тинидазола

Точность определения была оценена в выборке из 10 измерений для 500 мг тинидазола [28]. Результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2.

Оценка точности определения 500 мг тинидазола в таблетках

Результаты показали хорошую точность УФ- определения тинидазола в модельных образцах, что подтверждает работоспособность разработанной методики для применения в количественном определении тинидазола в фармацевтических препаратах.

Было проведено определение тинидазола в таблетках, выпускаемых различными фармацевтическими компаниями. Результаты измерений приводятся в таблице 3   .

Таблица 3.

Определение тинидазола в таблетках по предлагаемой методике

Сравнивая полученные результаты с литературными [15,16, 29, 30], можно констатировать, что разработанный метод не уступает другим известным методом определения тинидазола в фармпрепаратах, а кое в чем превосходит их по простоте и экономичности.

Выводы

Предложен спектрофотометрический способ определения тинидазола в фармацевтических препаратах, заключающийся в измерении величины световой абсорбции на длине волны 317,3 нм против фосфатного буфера с рН6,86. Проведена валидация методики в определении действующего вещества в фармацевтической продукции различных фирм производителей. Предлагаемый спектрофотометрический метод определения тинидазола является простым, точным, чувствительным, надежным и экономичным, что позволяет его применяться в качестве рутинного метода определения стабильности для оценки тинидазола в лабораториях контроля качества лекарственных средств.

Список литературы:

1. Тинидазол /http://Wikipedia.org/wiki. Дата обращения 20.09.2021.
2. Гомберг М.А., Плахова К.И. О терапии трихомоноза и бактериального вагиноза // Вестн. дерматол. и венерол. - 2006. -Т.1. - С. 60-63.
3. Anthwal A., Rawat D., Rawat M. 5-Nitroimidazole derivatives: A scope of Modification for Medicinal chemists // Research Journal of Chemical Sciences. 2013; 3(7):104-113.
4. Царев В.Н., Ушаков Р.В., Нуруев Н.Н., Ушаков А.Р., Трефилова Ю.А., Лабазанов А.А. Микробиологическое обоснование применения комбинации ципрофлоксацина и тинидазола для антимикробной химиотерапии в стоматологии // Медицинский алфавит. – 2021. -№2. – С.18-22. https://doi.org/10.33667/2078-5631-2021-2-18-22
5. Иванов О.Л., Ломоносов К.М., Алленов С.Н., Изюмова И.М. Опыт лечения острого трихомонадного уретрита // Российский журнал кожных и венерических болезней. - 1999. - № 3. -С. 57.
6. Фармакопейная статья ФС 42-0281-07. Тинидазол.
7. Фармакопейная статья ФС 42-12824-03. Таблетки тинидазола, покрытые оболочкой, 500 мг
8. Nagegowda P., Basavaiah K. Assay of tinidazole by titrimetry and spectrophotometry in non-aqueous medium // Bulg. Chem. Commun. - 2004. - Vol. 36, No 2. - P. 100 - 106.
9. Желтвай О.И., Желтвай И.И., Спинул В.В., Антонович В.П. Спектрофотометрическое определение метронидазола и тинидазола с помощью комплексов меди (II) / О.И. // Журн. аналит. химии. -2013. - Т. 68. - № 7 - С. 663 - 668.
10. Беликов В.Г. Спектрофотометрическое определение метронидазола и этимизола при совместном присутствии в моче // Судеб.-мед. экспертиза. - 1995. - № 4. - С. 27 - 29.
11. Бейсенбеков A.C., Каэкенова К.З., Келиллхинова С.Е., Мурзахлетов Г.А. Фотоэлектроколориметрический метод определения метронидазола в таблетках // Науч. тр. НИИФ. 1992.-Т. 30.-С. 25-28.
12. Nagaraja P., et.al. Spectrophotometric determination of metronidazole and tinidazole in pharmaceutical preparations // J. Pharm. Biomed. Anal. - 2002. - Vol. 28, No 3-4. - P. 527 - 535.
13. Lopez-Martinez L., Luna V.F.J., Lopez-de-Alba P.L. Simple spectrophotometric determination of tinidazole in formulation and serum // Anal. Chim. Acta. - 1997. - Vol. 340, No 1. -P. 241 -244.
14. Bhargav Y, et al. Method development and validation for the simultaneous estimation of Ofloxacin and Tinidazole in bulk and pharmaceutical dosage form by reverse phase HPLC method // J. Research in Pharmacy and Biotechnology. - 2013; No1(6). – P.797-802.
15. Gummadi S., Thota D., Varri S., Pratyusha V., Jillella V. Development and validation of UV spectroscopic methods for simultaneous estimation of ciprofloxacin and tinidazole in tablet formulation // International Current Pharmaceutical. – 2012, No 1(10). –C.317-321.
16. Pant M, Dadare K, Khatri N. Application of UV spectrophotometric methods for simultaneous estimation of norfloxacin and tinidazole in bulk and tablet dosage forms // J. Der Pharma Chemica. – 2012. -No 4(3). –P.1041-1046.
17. Pereira F. C., et.al. Differential pulse Polarographie determination of clotrimazole after derivatization with Procion Red HE-3B // J. Pharm. Biomed. Anal. - 2002. - Vol. 27, No 1-2. - P.201 – 208.
18. Ozkan S. A. Voltammetric determination of tinidazole in tablets // Analusis. - 1997.-Vol. 25. - No 4. - P. 130- 131.
19. Roychowdhury U., Das S.K. Rapid identification and quantitation of clotrimazole, miconazole, and ketokonazole in pharmaceutical creams and ointments by thin-layer chromatography-densitometry // J. AOAC - 1996. - Vol. 79, No 3. - P.656 - 659.
20. Kasnia V., Kumar M., Mahadevan N. Simultaneous Estimation of Amoxicillin, Tinidazole and Omeprazole in Microsphere Formulation by RP-HPLC // International Journal of Recent Advances in Pharmaceutical Research. – 2012, No 2(2). – P.78-83.
21. Ouyang L. Q. , et al. Simultaneous determination of metronidazole and tinidazole in plasma by using HPLC-DAD coupled with second-order calibration // Chin. Chem. Lett. - 2010. - Vol. 21, No 10. - P. 1223 - 1226.
22. Теплых А.Н.,   Илларионова Е.А. Количественное определение тинидазола спектрофотометрическим методом // Сибирский медицинский журнал. - 2010, № 8. – С.64-66
23. Илларионова Е.А., Сыроватский И.П., Артасюк Е.М. Спектрофотометрическое определение пиразидола // Журн. аналит. химии. - 2004. - № 6. - С. 3 - 6.
24. Prajapati B, Seth A, Molvi K, Mansuri M, Desai D. Synthesis of some novel 2-substituted nitroimidazole as potent anti-anaerobic agent // Pharma Science Monitor. – 2012. -No3(2). – P. 125-132.
25. Abou-Taleb N., El-Sherbiny D., El-Wasseef D., Abu El- Enin M., El-Ashry S. Simultaneous Determination of Norfloxacin and Tinidazole Binary Mixture by Difference Spectroscopy // Int. J. Biomed. Sci. – 2011. – Vol.7, No2. – P.137-144.
26. ICH (Q2 R1). Harmonized tripartite guideline validation of analytical procedures: text and methodology, 2005. European Medicines Agency. Science Medicines Health / https://www.ema.europa.eu/en/ich-q2-r1-validation-analytical-procedures-text-methodology. Дата обращения 20.09.2021
27. Мурашкина И.А., Гордеева В.В. Вспомогательные вещества в фармацевтической технологии. Учебное пособие.-Иркутск: ИГМУ, 2018.– 64с.
28. Аронбаев Д.М., Аронбаев С.Д. Рузиев Э.А., Нармаева Г.З Статистическая обработка результатов химического эксперимента. Просто о серьезных вещах. Методические указания для студентов химических факультетов (на русском и узбекском языках). - Самарканд, СамГУ. 2019. – 76 с.
29. Bhalerao S., Rote A. Application of UV spectrophotometric methods for estimation of ciprofloxacin and tinidazole in combined tablet dosage form // Int. J. Pharm. Pharm. Sci. -2012. - No 4(3). – P.646-467.
30. Alhemiarya N., Saleh M. Spectrophotometric Determination of Tinidazole Using Promethazine and Ethyl Vanillin Reagents in Pharmaceutical Preparations // J. Der Pharma Chemica. -2012. –Vol. 4, No 6. – P.2152-2160.