ПОИСК ФОСФАТМОБИЛИЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ В ПОЧВАХ УЗБЕКИСТАНА

АННОТАЦИЯ

Из ризосферы пшеницы сортов «Марварид» и «Туркистан», культивируемых в условиях Кашкадарьинской области Узбекистана, выделено в чистую культуру более 100 штаммов ризобактерий. Исследована кислотообразующая способность выделенных культур. В результате скрининга по фосфатмобилизующей способности отобрано 32 штамма ризобактерий и по выделению органических кислот отобрано 7 наиболее активных местных штаммов ризобактерий.

ABSTRACT

More than 100 strains of rhizobacteria have been isolated from the rhizosphere of wheat varieties "Marvarid" and "Turkistan" cultivated in the Kashkadarya region of Uzbekistan. The acid-forming ability of the isolated cultures was investigated. As a result of screening for phosphate-mobilizing ability, 32 strains of rhizobacteria were selected and 7 most active local strains of rhizobacteria were selected for the release of organic acids.

Ключевые слова: фосфор, ризосфера, культура, штамм, ризобактерия, фосформобилизация, кислотообразование. 

Keywords: phosphorus, rhizosphere, culture, strain, rhizobacteria, phosphomobilization, acid formation.

Введение

Фосфор является важнейшим элементом, обеспечивающим высокую продуктивность растений в сельском хозяйстве. Он относится к основным питательным элементам, обеспечивающим благоприятное влияние на рост и развитие растений, ускорение образования репродуктивных органов и созревание растений, формирование высоких и устойчивых урожаев сельскохозяйственных культур с благоприятным качеством товарной продукции. Наибольшую питательную ценность для культурных растений имеют легкоусвояемые соединения фосфора из почвы и удобрений [1, 2].  Многими исследователями отмечена способность ризосферных бактерий растворять труднодоступные почвенные фосфаты как важный механизм положительного действия на фосфорное питание растений. Динамика почвенного фосфора характеризуется физико-химическими (сорбция-десорбция) и биологическими (иммобилизация-минерализация) процессами. Большое количество фосфора, применяемого как удобрение превращается в неподвижную форму посредством осаждения при взаимодействии с высоко реактивными Al³⁺ и Fe³⁺ в кислых, и с Ca²⁺ в кальцированных или нормальных почвах [3, 4, 5]. Явление накопления и осаждения фосфора в почвах зависит от рН и типа почв. Так, в кислых почвах, фосфор закрепляется посредством свободных оксидов и гидроокисдов алюминия и железа, тогда как, в щелочных почвах он закрепляется посредством кальция, вызывая низкую эффективность растворимых фосфорных удобрений [6]. Растворение фосфатов происходит посредством различных микробных механизмов, включающих синтез органических кислот и замещение протона. Микроорганизмы повышают доступность фосфора для растений путем минерализации органического и растворения осажденных фосфатов в почве [7-10].

Большая часть неорганических фосфорных соединений в почве подразделяется на кальций, железо и алюминий содержащие формы. Неорганические формы фосфора растворяются группой гетеротрофных микроорганизмов, выделяющих органические кислоты, которые растворяют фосфатные минералы и/или хелатные катионные комплексы ионов фосфора т.е. PO₄^3- непосредственно, освобождая фосфор в растворе [11]. Почвенные фосфаты, в основном апатиты и метаболиты фосфорных удобрений при щелочных условиях закрепляются в форме фосфатов кальция (трикальцийфосфат) [12]. Растворение неорганических фосфатов - трикальцийфосфата результат комбинированного действия понижения рН и продуцирование органических кислот микроорганизмами. Эти микроорганизмы, выделяют разные типы органических кислот (карбоновые), которые понижают рН в ризосфере и в щелочных почвах, следовательно, разобщая связанные формы фосфатов, таких как Ca₃(PO₄)₂ [13].

Подвижность соединений фосфора в почве зависит не только от кислотности почвы, но и от содержания органического вещества, влажности почвы, аэрации, присутствия растительных и микробных метаболитов. В почвах с высоким содержанием гумуса происходит образование углекислоты, гуминовых и фульвокислот, переводящих труднорастворимые соединения фосфора в доступную для растений форму [14].

Фосфор, влияет на многие биохимические процессы в растениях. При его недостатке в растениях тормозится синтез белков и углеводов, происходит задержка роста, наблюдается заметное снижение урожая. При достаточном содержании фосфора ускоряется рост и развитие растений, образование репродуктивных органов и созревание растений, увеличивается урожайность и качество сельскохозяйственных культур [15, 16].

Повышение доступности труднорастворимых фосфатов почвы для растений может обеспечить биологическая фосфатмобилизация за счет почвенной микрофлоры, а также при использовании бактериальных удобрений на основе фосфатмобилизующих бактерий [17].

Поиск путей мобилизации фосфора из труднорастворимых соединений и перевод в легкодоступные для растений формы – одна из актуальных проблем.

Исходя из вышесказанного, целью исследований является выделение, скрининг и изучение фосформобилизующей активности местных штаммов ризосферных бактерий пшеницы.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования являлись ризобактериальные изоляты, выделенные в чистую культуру из ризосферы  пшеницы сортов «Марварид», «Туркистан», культивируемых в условиях Кашкадарьинской области Республики Узбекистан.

Из ризосферы пшеницы сортов «Марварид» и «Туркистан»  в фазе всходов, стерильно отбирали образцы почв в количестве 10 г,  помещали в стерильную воду (100 мл), встряхивали в течение 30 мин. Содержание микроорганизмов определяли общепринятым методом предельных разведений и высевом на среду МПА и Пиковской (с трикальцийфосфатом). Отдельные колонии пересевали в пробирки со скошенным агаром. Расчистку культур проводили на МПА методом поверхностного посева истощающим штрихом. Чистые культуры микроскопировали и сохраняли на скошенном агаре в холодильнике [18].

Качественный тест на кислотообразование выделенных ризосферных бактерий проверяли на среде Пиковской с Са₃(РО₄)₂  с индикатором. Исходный цвет питательной среды был темно фиолетового цвета. В случае изменения реакции среды в кислую сторону под действием ризобактериальных метаболитов происходило обесцвечивание питательной среды.

Определение общего количества титруемых кислот проводили по методу Ермакова А.И. [19]. Пептонную воду с добавлением глюкозы и NaCl засевали монокультурами ризобактерий и культивировали в термостате при температуре 28⁰С. Общее количество титруемых кислот в питательной среде проверяли в динамике (1, 3, 5, 7 и 10 сутки). Культуральную жидкость в количестве 5 мл помещали в конические колбы объемом 200 мл и добавляли в качестве индикатора 4-5 капель фенолфталеина и титровали 0,1 н раствором NaOH до появления устойчивой слабо розовой окраски. Общее содержание кислот в переводе на молочную выражали в процентах и вычисляли по следующей формуле:

где, a – количество см³ 0,1 н NaOH, израсходованное на титрование; b - объем культуральной жидкости взятой на титрование, х – общее количество титруемых кислот в данном эксперименте.

Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли стандартными методами расчета ошибок, средних, доверительных интервалов, стандартных отклонений. Все расчеты и математические анализы выполнены с помощью программы Microsoft Excel 2007 [20].

 Результаты исследования и их обсуждение

Из ризосферы пшеницы выделено в чистую культуру более 100 штаммов ризобактерий. В результате проведенного качественного теста выделенных культур на кислотообразующую способность было отобрано 32 штамма ризобактерий. Как показывают результаты, из 100 выделенных ризобактерий пшеницы наиболее активными по кислотообразованию в ранние сроки инкубации оказались 13 культур, кислотообразование которых составило 90-100% уже на 1 сутки опыта. Наименьшую кислотообразующую способность, равную 70-80% показали 14 культур, на 1 сутки опыта, а на 3 и 5 сутки опыта кислотообразование этих культур составляло 100%. 100%-ное кислотообразование культур №№ 21R, 22R, 23R и 30R наблюдалось  на 15 сутки опыта. На рисунке 1, представлена кислотообразующая способность выделенных ризобактерий по изменению цвета питательной среды (качественный тест).

Рисунок 1. Кислотообразующая способность активных культур ризобактерий (качественный тест на 3 сутки)

Таким образом, в результате первичного скрининга по качественной характеристике кислотообразующей способности было отобрано 32 наиболее активных  штаммов ризобактерий. выглядит

В следующей серии опытов, определено общее  количество  титруемых кислот отобранными активными кислотообразователями. Определяли общее количество титруемых кислот, выделяемых отобранными активными кислотообразователями. Полученные результаты подтвердили данные качественного теста на кислотообразование. В таблице 1 представлены результаты общего количество титруемых кислот, выделяемых отобранными культурами ризобактерий.

Таблица 1.

Общее количество титруемых кислот, выделяемых активными культурами ризобактерий пшеницы, (%)

Культуры №№ 14, 1 и 1R наиболее активно выделяли кислоты относительно других культур, общая кислотность которых уже в первые сутки опыта составляла от 19,2±0,21 до 23,4±0,26%, к концу опыта на 10-е сутки составила 22,6±0,23 - 33,2±0,28%. Несколько ниже по активности выделения кислот на вторые сутки опыта были культуры №№ 3, 9, 17 и 8, общая кислотность их составила 20,0±0,12-27,4±0,25%. Активное кислотообразование культуры № 18 отмечено на пятые сутки опыта, при этом общая кислотность составила 21,4±0,17%, к концу опыта на 10-е сутки 30,7±0,28%. Общая кислотность бактерий №№ 2, 10, 12 и 30R была наиболее активной на седьмые сутки опыта от 18,6±0,12 до 20,6±0,17%, а к концу опыта на 10-е сутки - от 26,0±0,25 до 30,6±0,26%. Совсем иная картина наблюдалась у культур №№ 4, 7 и 16, на 7-е сутки опыта они выделяли до 8,6±0,09%, на 10-е сутки опыта составила от 2,0±0,01 до 4,0±0,03% .

Таким образом, в результате скрининга по кислотообразующей активности было отобрано 7 наиболее активных местных штаммов ризобактерий пшеницы – №№1, 3, 9, 14, 18, 1R и 30R, которые потенциально способны растворять Ca₃(PO₄), выделяя кислоты.

Список литературы:

1. Белясова Н.А., Игнатовец О.С., Сергиевич Д.С., Минаковский А.Ф., Босак В.Н., Сачивко Т.В. Выделение и характеристика почвенных фосфатмобилизующих микроорганизмов // Журнал Вестник Белорусской государственной сельскохозяйственной академии. 2018. С. 93-97.
2. Azziz G., Bajsa N., Haghjou T., Taulé C., Valverde A., Igual J. Abundance, diversity and prospecting of culturable phosphate solubilizing bacteria on soils under crop–pasture rotations in a no-tillage regime in Uruguay. Appl. Soil Ecol. 2012. 61, 320–326.
3. Ezawa T., Smith S.E., Smith F.A. P metabolism and transport in AM fungi // Plant Soil, 2002. vol. 244. pp. 221-230.
4. Gyaneshwar P., Kumar G.N., Parekh L.J., Poole P. S. Role of soil microorganisms in improving P nutrition of plants. // Plant Soil, 2002. vol. 245. - pp. 83-93.
5. Hao X., Cho C.M., Racz G.J., Chang C. Chemical retardation of phosphate diffusion in an acid soil as affected by liming // Nutr., Cycl., Agroecosys., 2002. vol. 64. pp. 213-224.
6. Landeweert R., Hoffland E., Finlay R.D., Kuper T.W., Van Breemen N. Linking plants to rocks, ectomycorrhizal fungi mobilize nutrients from minerals //Trends Ecol., Evol., 2001. vol.16. pp. 248-253.
7. Khan K.S., Joergensen R.G. Changes in microbial biomass and P fractions in biogenic household waste compost amended with inorganic P fertilizers // Bioresour.Technol., 2009. vol. 100. pp. 303-309.
8. Chen Y.P., Rekha P.D., Arunshen A.B., Lai W.A., Young C.C. Phosphate solubilizing bacteria from subtropical soil and their tricalcium phosphate solubilizing abilities //Appl. Soil Ecol., 2006. vol. 34. pp. 33-41.
9. Pradhan N., Sukla L.B. Solubilization of inorganic phosphate by fungi isolated from agriculture soil // African J. Biotechnol., 2005. vol. 5. pp. 850-854.
10. Kang S.C., Hat C.G., Lee T.G., Maheshwari D.K. Solubilization of insoluble inorganic phosphates by a soil-inhabiting fungus Fomitopsis sp. PS 102 // Curr. Sci., 2002. vol. 82. pp. 439-442.
11. He Z.L., Bian W., Zhu J. Screening and identification of microorganisms capable of utilizing phosphate adsorbed by goethite. Comm. Soil Sci. Plant Anal., 2002. vol. 33. pp. 647-663.
12. Goldstein A. H. Bioprocessing of rock phosphate ore: essential technical considerations for the development of a successful commercial technology // In Proc. 4th Int. Fert. Assoc. Tech. Conf.. IFA, Paris., 2000. рp. 220.
13. Fankem H., Nwaga D., Deubel A., Dieng L., Merbach W., Etoa F.X. Occurrence and functioning of phosphate solubilizing microorganisms from oil palm tree (Elaeis guineensis) rhizosphere in Cameroon // African J. Biotech., 2006. vol. 5. pp. 2450-2460.
14. Козловская И.П., Босак В.Н. Производственные технологии в агрономии. М.: Инфра–М, 2016. 336 с.
15. Босак В.Н. Оптимизация питания растений. Saarbrücken: Lambert Academic Publishing, 2012. 203 с.
16. Справочник агронома / И.Р. Вильдфлуш [и др.]. Горки: БГСХА, 2017. 315 с.
17. Whitelaw M. A. Growth promotion of plants inoculated with phosphate solubilizing fungi // Adv. Agron., 2000. vol. 69. pp. 99-151.
18. Rashid M., Samina K., Najma A., Sadia A., Farooq L. Organic acids production and phosphate solubilization by phosphate solubilizing microorganisms under in vitro conditions // Pak. J. Biol. Sci., 2004. vol. 7. pp. 187-196.
19. Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. Москва, 1991. 350 с.
20. Ермаков А.И. Методы биохимических исследований растений. Ленинград 1972, с.192-194.
21. Larkin M.A., Blackshields G., Brown N.P., Chenna R., McGettigan P.A., McWilliam H., Valentin F., Wallace I.M., Wilm, A., Lopez R., Thompson J.D., Gibson T.J., Higgins D.G. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 2007. vol. 23. pp. 2947-2948.