Фитохимический скрининг и антирадикальная активность экстрактов растений, произрастающих в Узбекистане

АННОТАЦИЯ

В данной работе проведены фитохимические исследования некоторых растительных экстрактов, полученных из лекарственных растений, произрастающих на территории Узбекистана. Экстракты растений получены 6-7 часовым экстрагированием в 70-% этаноле. Во всех исследованных экстрактах были обнаружены флавоноиды, причём наибольшие количество было получено у Tanacetum pseudoachilea L. (3,659 мг/100 мг) и Petroselinum crispu L. (3,293 мг/100 мг), минимальное – у Ajuga turkestanica L. Максимальное количество фенолов наблюдалось у образцов Mentha longifolia L. (2,154 мг/100 мг) и Leonorus turkestanicus L. (1,999 мг/100 г), наименьшее также у  Ajuga turkestanica L. У эндемика Ajuga turkestanica L. зафиксировали наибольшее содержание сапонинов (1,122 мкг/100 мг). Танинов было больше у образцов. Petroselinum crispum L. (462 мкг/100 мг) и Zea mays L. (453 мкг/100 мг), меньше всего у Ajuga turkestanica L.. Результаты исследования показали, что изученные нами растительные экстракты проявляют антирадикальные свойства по отношению к радикалу дифенилпикрилгидразилу (ДФПГ).

ABSTRACT

In the article, phytochemical investigations of some plant extracts obtained from medicinal plants growing on the territory of Uzbekistan have been carried out. Plant extracts are obtained by 6-7 hour extraction in 70% ethanol. Flavonoids have been found in all the studied extracts, with the largest amounts obtained in Tanacetum pseudoachilea L. (3,659 mg/100 mg) and Petroselinum crispu L (3,293 mg/100 mg), the minimum-in Ajuga turkestanica L. The maximum amount of phenols has been observed in the samples of Mentha longifolia L. (2,154 mg/100 mg) and Leonorus turkestanicus L. (1,999 mg/100 g), the smallest also in Ajuga turkestanica L. The endemic Ajuga turkestanica L. the highest content of saponins (1,122 micrograms/100 mg) has been recorded. The samples had more tannins Petroselinum crispum L. (462 mcg/100 mg) and Zea mays L. (453 mcg/100 mg), the least in Ajuga turkestanica L. The research results have showed that the plant extracts studied by us exhibit anti-radical properties with respect to the radical diphenyl picryl hydrazyl (DPH).

Ключевые слова: эндемик, окислительный стресс, свободные радикалы, вторичные метаболиты.

Keywords: endemic; oxidative stress; free radicals; secondary metabolites. 

Активные формы кислорода (АФК) и свободные радикалы (СР) являются промежуточными продуктами нормального метаболизма и играют решающую роль в передаче клеточных сигналов. Напротив, накопление избыточных АФК и СР провоцирует развитие окислительного стресса, который часто приводит к разнообразным нарушениям, включая снижение уровня АТФ в клетках, повышение цитозольного Ca²⁺, повреждение ДНК, нарушение биологической функции липидного бислоя и т.д. Научные исследования последних десятилетий показывают, что окислительный стресс предшествует или сопутствует многим болезням – сердечнососудистым [15], онкологическим [13], сахарному диабету [6], нарушениям мозгового кровообращения [2], воспалительным [8], ревматоидным [12], нейродегенеративным (Паркинсона, Альцгеймера, шизофрении, аутизму) [17]. Успехи традиционного народного лечения лекарственными растениями всегда побуждали исследователей искать новые средства, способствующие поддержанию здорового образа жизни. Кроме того, потенциал многих лекарственных растений все ещё не до конца изучен и требует дальнейшего научного изучения. Немаловажным является также установление способности растительных экстрактов проявлять мощную антиооксидантную активность.

В настоящее время применение целебных трав и аптечных сборов на их основе в традиционной и народной медицине особенно актуально, что обусловлено определенным преимуществом растений по сравнению с химическими медикаментозными препаратами.

Флора Узбекистана богата малоизученными перспективными растениями, которые применяют в народной медицине, в связи с чем возникает необходимость изучения и внедрения экстрактов растений, как природных источников антиоксидантов.

Материалы и методы.

Экстракция растений. В работе использовали растения, собранные в летний период 2020 года в горных районах и в окрестностях населённых пунктов Ангрен и Бричмулла (Узбекистан) – Ajuga turkestanica L., Petroselinum crispum L., Leonurus cardiaca  L., Matricaria recutita L., Tanacetum vulgare L., Zea mays L., Mentha spicata L., Inula helenium L. Высушенные образцы измельчали до мелкодисперсного состояния и хранили в эксикаторах до экстракции. Экстракцию проводили в течение 12 ч 70% этанолом. Затем растворитель выпаривали с использованием роторного испарителя при +50°C и концентрировали в вакууме до тех пор, пока процентное содержание влаги не стало менее 15%.

Все реактивы, используемые в настоящем исследовании, имели квалификацию «хч» и «чда».

Качественный анализ растительных экстрактов.

Полученные экстракты растений анализировали на наличие сапонинов, флавоноидов, углеводов, белков, фенолов, терпентинов, алкалоидов, стероидов и сердечных гликозидов.

Качественная реакция на флавоноиды.

В экстракт растений добавляли несколько капель едкой щелочи (NaOH) с последующим добавлением 2-3 капель HCl. Наличие флавоноидов подтверждали обесцвечиванием щелочного раствора при добавлении соляной кислоты [11].

Качественная реакция на редуцирующие сахара.

К экстракту добавляли несколько капель реагента Бенедикта и кипятили на водяной бане [3]. Наличие редуцирующих сахаров подтверждали выпадением осадка красно-коричневого цвета.

Качественная реакция на сапонины.

Наличие сапонинов определяли по образованию обильной и стойкой пены при энергичном встряхивании водного раствора экстрактов [14].

Качественная реакция на фенолы.

Присутствие фенолов в экстракте подтверждали появлением фиолетового окраса при добавлении к нему 1% FeCl₃ [16].

Качественная реакция на протеины.

Наличие протеинов определяли при помощи Биуретового реагента согласно [5].

Качественная реакция на терпеноиды.

Наличие терпеноидов определяли при помощи реакции Salkowski согласно [4].

Качественная реакция на алкалоиды.

Наличие алкалоидов определяли при помощи реактива Mayer согласно [9].

Качественная реакция на антрахиноны.

Наличие алкалоидов определяли при помощи теста Borntrager согласно [1].

Качественная реакция на сердечные гликозиды.

Наличие сердечных гликозидов определяли при помощи теста Keller-Kilian согласно [14].

Качественная реакция на стероиды.

Наличие стероидов определяли при помощи теста Lieberman-Burghardt согласно [1].

Общее содержание флавоноидов.

Общее содержание флавоноидов оценивали согласно [18] спектрофотометрически при 510 нм. Рутин использовали в качестве стандарта для построения калибровочной кривой.

Общее содержание фенолов.

Общее содержание фенолов оценивали согласно [18] спектрофотометрически при 765 нм. В качестве стандарта для построения калибровочной кривой использовали галловую кислоту.

Общее содержание сапонинов.

Общее содержание сапонинов оценивали согласно [18] спектрофотометрически при 544 нм. В качестве стандарта для построения калибровочной кривой использовали глицирризиновую кислоту.

Общее содержание танинов.

Общее содержание танинов оценивали согласно [10] спектрофотометрически при 500 нм. В качестве стандарта для построения калибровочной кривой использовали эпигалокатехин.

Определение антирадикальной активности

Антирадикальную активность определяли с помощью стандартного метода измерения кинетики реакции по изменению оптической плотности спиртового раствора радикала ДФПГ свободного (1,1-дифенил-2-пикрилгидразил) в присутствии исследуемых экстрактов согласно [7].

Статистическая обработка данных.

Данные анализировали с использованием программы OriginPro, версии 5-8 (OriginLab Corporation, Northampton, MA, США). Все данные приведены как среднее значение ± стандартная ошибка для n экспериментов. Сравнения между двумя экспериментальными группами проводились с помощью t-теста Стьюдента или вариационного анализа (ANOVA). Различия считались статистически значимыми при P<0,05.

Результаты и обсуждение.

На протяжении многих лет лекарственным травам приписывались преимущества, связанные с содержанием в них полифенольных соединений с антиоксидантной активностью. Антиоксидантное поведение полифенольных компонентов связано с их способностью задерживать или предотвращать автоокисление или окисление и связывать свободные радикалы, образуя более стабильные соединения, которые не могут подвергаться последующему окислению. Поскольку антиоксиданты, содержащиеся в большом количестве в растении, находятся на первом месте по снижению риска многих заболеваний, цель настоящего исследования была направлена ​​на предварительный скрининг лекарственных растений, на предмет их фитохимического содержания и антиоксидантной активности.

Фитохимический анализ экстрактов представлен в таблице 1.

Танины, фенолы и флавоноиды были обнаружены во всех растительных экстрактах, в том время как наибольшее содержание сапонинов было представлено в экстракте Ajuga turkestanica L.

Таблица 1.

Фитохимический скрининг выбранных экстрактов растений 

Общее содержание флавоноидов в экстрактах определяли количественно путём калибровки рутином (рис. 1). Уравнение регрессии стандартной кривой рутина представлено линейной зависимостью y=1,0933x с коэффициентом корреляции R²=0,9905.

Рисунок 1. Общее содержание флавоноидов в растительных экстрактах

Определение общего содержания фенолов показало наиболее высокие значения у образцов Leonurus turkestanucus L. и Mentha longifolia L.  Уравнение регрессии стандартной кривой галловой кислоты также было выражено зависимостью y = 0,0081x + 0,0151 с коэффициентом корреляции R²=0,9905.

Рисунок 2. Общее содержание фенолов в растительных экстрактах

При определении общего содержания танинов наиболее высокие значения наблюдались у образцов Petroselinum crispum L. и Zea mays L. (рис. 3). Уравнение регрессии калибровочной кривой по эпигалокатехину также было выражено зависимостью y = 0,3629x + 0,2201 с R² = 0,9818.

Рисунок 3. Общее содержание танинов в растительных экстрактах

Анализ на общее содержание сапонинов подтвердил результаты экспериментов качественного анализа. Так, наибольшее содержание сапонинов наблюдалось у образца Ajuga turkestanica L.

Рисунок 4. Общее содержание сапонинов в растительных экстрактах

Исследованные экстракты проявили высокую антирадикальную активность по отношению к свободному радикалу ДФПГ. Наиболее высокое значение IC50 наблюдалось у экстрактов Ajuga turkestanica L. и Petroselinum crispum L. (таблица 2).

Таблица 2.

Антиоксидантная активность исследованных растительных экстрактов

Заключение.

В данной работе проведены фитохимические исследования некоторых лекарственных растений Узбекистана, включая эндемик – Живучка туркестанская. Наличие таких биологически активных компонентов как флавоноиды, фенолы, танины обусловило высокую антирадикальную активность экстрактов. В настоящее время в условиях экологического кризиса и избыточного потребления ксенобиотиков применение антиоксидантов для снижения окислительного стресса является важным звеном в плане коррекции профилактики широкого спектра заболеваний. Это обусловливает повышенный интерес к поиску профилактических и лечебных антиоксидантных средств природного происхождения. Таким образом, вызывает особый интерес исследование по качественному и количественному составу, а также антирадикальной активности экстрактов лекарственных растений с целью дальнейшей разработки и создания на основе изученных растений импортозамещающих лекарственных средств профилактического и направленного действия.

Список литературы:

1. Antimicrobial effects of Indian medicinal plants against acne-inducing bacteria / G.S. Kumar, K.N. Jayaveera, C.K.A. Kumar, U.P. Sanjay [et al.] // Trop J Pharm Res. – 2007. – № 6. – P. 717–723.
2. Chronic Exposure to Sodium Fluoride Triggers Oxidative Biochemistry Misbalance in Mice: Effects on Peripheral Blood Circulation / G. Miranda, B. Gomes, L.O. Bittencourt, W. Aragão [et al.] // Oxidative medicine and cellular longevity. – 2018. – 8379123 / [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://doi.org/10.1155/2018/8379123.
3. Dwivedi A., Argal A. Extraction and Preliminary Phytochemical Screening of Leaves and Seeds of Abelmoschus Moschatus Medik // American Journal of Life Science Researches. – 2017. – № 5 (3). – P. 126–129.
4. Edeoga H.O., Okwu D.E., Mbaebie B.O. Phytochemical constituents of some Nigerian medicinal plants // AfrJ Biotechnol. – 2005. – № 4. – P. 685–688.
5. Extraction, isolation and characterization of bioactive compounds from plants' extracts / S. Sasidharan, Y. Chen, D. Saravanan, K.M. Sundram // African journal of traditional, complementary, and alternative medicines: AJTCAM. – 2011. – № 8 (1). – P. 1–10.
6. Giacco F., Brownlee M. Oxidative stress and diabetic complications // Circulation research. – 2010. – № 107 (9). – P. 1058–1070 / [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.110.223545.
7. In Vitro Screening of Antioxidant and Antimicrobial Activities of Medicinal Plants Growing in Slovakia / S. Gayibova, E. Ivanišová, J. Árvay, M. Hŕstková [et al.] // Journal of microbiology, biotechnology and food sciences. – 2019. – № 8. – P. 1281–1289.
8. Insights into the Role and Interdependence of Oxidative Stress and Inflammation in Liver Diseases / S. Li, M. Hong, H.Y. Tan, N. Wang [et al.] // Oxidative medicine and cellular longevity. – 2016. – 4234061 / [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://doi.org/10.1155/2016/4234061.
9. Kumar S., Singh B.B., Kumar N. Physico-chemical and phytochemical investigation of plant Sesbania sesban // Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. – 2014. – № 5. – P. 110–117.
10. Makkar H.P.S., Francis G., Becker K. Bioactivity of phytochemicals in some lesser-known plants and their effects and potential applications in livestock and aquaculture production systems // Animal. – 2007. – № 1. – P. 1371–1391.
11. Onwukaeme D.N., Ikuegbvweha T.B., Asonye C.C. Evaluation of Phytochemical Constituents, Antibacterial Activities and Effect of Exudate of Pycanthus Angolensis Weld Warb (Myristicaceae) on Corneal Ulcers in Rabbits // Tropical Journal of Pharmaceutical Research. – 2007. – Vol. 6. – Num 2.
12. Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis: What the Future Might Hold regarding Novel Biomarkers and Add-On Therapies / L. da Fonseca, V. Nunes-Souza, M. Goulart, L.A. Rabelo // Oxidative medicine and cellular longevity. – 2019. – 7536805 / [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://doi.org/10.1155/2019/7536805.
13. Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked? / S. Reuter, S.C. Gupta, M.M. Chaturvedi, B.B. Aggarwal // Free radical biology & medicine. – 2010. – № 49 (11). – P. 1603–1616 / [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2010.09.006.
14. Parekh J., Chanda S.V. In vitro antimicrobial activity and phytochemical analysis of some Indian medicinal plants // Turk J Biol. – 2007. – № 31. – P. 53–58.
15. Senoner T., Dichtl W. Oxidative Stress in Cardiovascular Diseases: Still a Therapeutic Target? // Nutrients. – 2019. – № 11 (9). – P. 2090 / [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://doi.org/10.3390/nu11092090.
16. Simple and rapid spectrophotometric method for phenol determination in aqueous media / L. Bulgariu, A. Georgiana, T. Ichim, V. Radu // Bulletin of the Polytechnic Institute of Jassy, CONSTRUCTIONS. ARCHITECTURE Section. – 2018. – № 64. – P. 9–18.
17. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases / G.H. Kim, J.E. Kim, S.J. Rhie, S. Yoon // Experimental neurobiology. – 2015. – № 24 (4). – P. 325–340 / [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://doi.org/10.5607/en.2015.24.4.325.
18. Zhishen J., Mengcheng T., Jianming W. The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals // Food Chem. – 1999. – № 64. – P. 555–559.