Количественное определение S-аллилцистеина и аллиина в препаратах чесночного порошка

АННОТАЦИЯ

Биологическая активность чеснока определяется присутствием ряда сероорганических соединений. Первичным, содержащим серу компонентом чеснока является гамма-глутамил-S-аллил-L-цистеин, из которого ферментативно образуется S-аллилцистеин («S-АЦ») и далее аллиин. В настоящей работе изучена возможность стандартизации данного препарата путем анализа таких характерных, нелетучих компонентов как S-АЦ и аллиин.

ABSTRACT

The biological activity of garlic is determined by the presence of a number of organosulfur compounds. The primary sulfur-containing component of garlic is gamma-glutamyl-S-allyl-L-cysteine, from which S-allylcysteine (“S-AC”) and further alliin are enzymatically formed. In this work, we studied the possibility of standardizing this drug by analyzing such characteristic, nonvolatile components as S-AC and alliin.

Ключевые слова: S-аллилцистеин, аллиин, дегидратированный порошок чеснока, аллилбромид, центрифугирование, стандартный образец, таблетка, субстанция, экстрагирование.

Keywords: S-allylcysteine, alliin, dehydrated garlic powder, allyl bromide, centrifugation, standard sample, tablet, substance, extraction.

Препараты чеснока (Allium sativum) успешно применяются как эффективные антиоксидантные, антимикробные, противовоспалительные и противоопухолевые средства. Биологическая активность чеснока определяется присутствием ряда сероорганических соединений. Первичным, содержащим серу компонентом чеснока является гамма-глутамил-S-аллил-L-цистеин, из которого ферментативно образуется S-аллилцистеин («S-АЦ») и далее аллиин. В свою очередь аллиин с участием аллииназы конвертируется в нестабильный летучий аллицин, который распадается в десятки других летучих компонентов. Так как технология получения таблеток чеснока основана на использовании сухого порошка чеснока, в настоящей работе изучена возможность стандартизации данного препарата путем анализа таких характерных, нелетучих компонентов как S-АЦ и аллиин. В литературе описано определение S-АЦ и аллиина обращено фазной ВЭЖХ, детектированием при 210 нм [1, 2]. Желая увеличить чувствительность и специфичность определения, принимая во внимание возможные экранирующие эффекты множества сероорганических компонентов чеснока было решено испытать способ определения изучаемых компонентов в виде фенилтиокарбамоильных (ФТК) производных. Предколоночная модификация аминокислот в виде ФТК-производных успешно применяется в аминокислотном анализе [3, 4]. Наряду с повышением чувствительности анализа этот подход упрощает количественный анализ разных аминокислот: молярный коэффициент поглощения ФТК-аминокислот при 280 нм равна 16000 (исключение составляет ФТК-лизина для которого молярный коэффициент два раза выше).   

Целью работы являлась разработка анализа количественного определения S-АЦ и аллиина методом ВЭЖХ в таблетках чесночного порошка.

Экспериментальная часть. В настоящей работе использованы свеже-очищенные дольки чеснока («сырой чеснок»), дегидратированный порошок чеснока, высушенный с помощью сублимационной установки и такой же порошок, полученный после предварительной термообработки горячей водой, а также таблетки – полученные из двух видов высушенных порошков чеснока. Стандартный образец S-аллилцистеина (S-АЦ) получали S-алкилированием цистеина алилбромидом как описано [5] с заменой аллилхлорида в оригинальной методике на аллибромид. 1 г цистина растворяли в 10 мл 0.1 М натрий цитратного буфера рН 9.0 и прибавляли 0.5 мл 2-меркаптоэтанола, для окончательного восстановления дисульфидных связей смесь нагревали 2 мин в кипящей водяной бане. Реакционную смесь затем замораживали жидким азотом и высушивали лиофильно. Полученный таким образом цистеин растворяли в 10 мл 0.05М NaOH без контроля рН и при перемешивании, небольшими порциями добавляли раствор 1 мл аллилбромида в 3 мл ацетонитрила. Аллилбромид должен быть свежеперегнанным, однако обработка вышеупомянутого раствора аллилбромида активированным углем также может быть использован для удаления продуктов окисления/осмоления. После прибавления последней капли раствора аллилромида смесь перемешивали при комнатной температуре еще 30 мин, затем охлаждали в ледяной бане и прибавляли ледяную уксусную кислоту до появления неисчезающего белого осадка S-аллилцистеина. Продукт отделяли центрифугированием, промывали холодным 10%-ным водным раствором уксусной кислоты и высушивали лиофильно. Стандартный образец аллиина получали из синтезированного как описано выше  S-АЦ путем его окисления в 0.05М натрий ацетатном буферном растворе рН 5.5, содержащем 3% перекиси водорода, при комнатной температуре в течение 5 часов.

Рисунок 1. ¹Н-ЯМР спектр S-аллилцистеина. Спектры сняты в растворе дейтерированного диметилсульфоксида с помощью спектрометра Unity 400+ (Varian, США) при 400 мГц

7          6       5        4      3            2                 1      

Н₂С = CH – CH₂ – S – CH₂ – CH(NH₂) – COOH  (S-аллилцистеин)

В спектре S-аллилцистеина выявляются сигналы, соответствующие протонам метиленовой (квартет при 5.1 – 5.2 м.д.) и метиновой (квартет при 5.7 – 5.8 м.д.) групп винильного остатка. В спектре аллина по сравнению со спектром S-аллилцистеина, из которого аллиин получен окислением, сигналы, соответствующие протонам СН₂ (мультиплет при 2.9 – 3.2 м.д.) и СН (квартет при 5.7 – 5.8 м.д.) групп цистеинового остатка претерпели некоторые изменения в характере расщепления, а также несколько смещены в слабое поле – которые объясняются эффектом SO группы.

Стандартные образцы S-АЦ и аллиина превращали в ФТК-производные аналогично получению ФТК-аминокислот [3]. S-АЦ и аллиин растворяли в очищенной воде в концентрации 0,1 мг/мл и к 50 мкл аликвоты этого раствора прибавляли 350 мкл ацетонитрила, 250 мкл пиридина, 50 мкл триэтиламина и 50 мкл фенилизотиоцианата («ФИТЦ», Sigma, США) смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин и высушивали с помощью спидвак системы (SpidVac, Eppendorf, США) при 45 ^оС в течение 30 мин. ФТК- S-АЦ растворяли в 0.5 мл 50%-ного водного ацетонитрила и перед нанесением на ВЭЖХ колонку фильтровали через фильтр. Из сырого чеснока, сухих субстанций, а также из готовых таблеток для анализа S-АЦ и аллиина перед получением ФТК-производных готовили депротеинизировавнный экстракт. Дольки сырого чеснока (5 г, точная навеска) растирали в ступке с 10%-ной трихлоруксусной кислотой (ТХУ) в соотношении 1 г чеснока: 1 мл ТХУ, гомогенат фильтровали через 4 слоя марли и выжимку еще 2 раза экстрагировали с ТХУ. Объединенный гомогенат центрифугировали 10 тыс об/мин, 3 мин. Супернатант переносили в мерную посуды, измерили объем экстракта. Из полученного экстракта отобрали аликвоту, соответствующую 1/100 части по объему. К аликвоте депротеинизированного кислотного экстракта прибавляли 150 мкл ацетонитрила, по 10 мкл пиридина и триэтиламина (ТЭА), в случае появления осадка смесь центрифугировали и удаляли осадок. Осветленную смесь затем высушивали с помощью спидвак системы (60 ^оС, 40 мин). Высушенный и обработанный экстракт чеснока заново растворяли в 350 мкл смеси ацетонитрила-пиридина-воды-ТЭА (7:1:1:1) и прибавляли 10 мкл ФИТЦ для получения ФТК-производного S-АЦ/аллиина. Реакционную смесь высушивали в спидвак системе, растворяли в исходном объеме взятой для анализа аликвоты экстракта и проводили ВЭЖХ как описано для стандарта. Депротеинизированные экстракты из сухих субстанции, предназначенных для получения таблеток готовили как описано для сырого чеснока с изменением пропорции субстанция: экстрагент = 1 г: 3 мл для первичной экстракции, последующие экстракции - как описано для сырого чеснока. ФТК-производные получали как описано в деталях для сырого чеснока. Депротеинизированный экстракт готовых таблеток готовили следующим образом: 10 таблеток измельчали в ступке до состояния гомогенного порошка и отобрали точную навеску, равную средней массе одной таблетки (403 мг). Навеску измельченных таблеток экстрагировали как описано для сухой субстанции с пропорцией 1 г таблеток: 1 мл экстрагента. ФТК-производные из экстракта таблеток получали, как описано в деталях для экстракта сырого чеснока.

ВЭЖХ проводили на хроматографе Beckman System Gold: программируемый насос - 126-2, УФ-детектор - 166, программа - Gold V.3.1, колонка - 25 х 0.46 см Ultrasphere C_18. Подвижная фаза: «А»- 0.014 М Na-ацетат рН 6.7, с 5% ацетонитрила; «B»- 60% ацетонитрил в воде; скорость потока 1 мл/мин. Программа насоса: с 0 до 1 мин - 2% «B»; с 1 до 16 мин градиент «В» от 2 до 50%; 16 до 17 мин градиент «В» от 50 до 98%; с 17 мин в течение 2 мин 98% «В»; с 19 мин обратный градиент «В» от 98 до 2%; Время анализа 20 мин; Детектирование при 280 нм.

Расчет содержания S-АЦ/аллиина в сыром чесноке и субстанциях проводили по формуле:

Содержание S-АЦ/аллиина  % =  (S_smp  x C_std x V x 100%)/(S_std  x M x 1000);

Где: 

S_smp - Площадь пика S-АЦ/аллиина в хроматограмме испытуемого образца экстракта чеснока, субстанции или таблеток;

C_std  - Концентрация S-АЦ/аллиина в растворе стандарта, мг/мл;

S_std - Площадь пика S-АЦ/аллиина в хроматограмме соответствующего стандарта;

V    - объем полученного депротеинизированного экстракта, мл;

М   - масса долек чеснока, субстанции или таблеток г;

100%  - Фактор для пересчета данных на 100 г материала;

1000   - Фактор для пересчета данных на г;

Расчет содержания S-АЦ/аллиина в готовых таблетках чеснока проводили по формуле:

Содержание S-АЦ/аллиина, мг/таблетку=  (S_smp  x C_std x V)/(S_std);

Где: 

S_smp- Площадь пика S-АЦ/аллиина в хроматограмме экстракта таблеток чеснока;

C_std - Концентрация S-АЦ/аллиина в растворе стандарта;

S_std- Площадь пика S-АЦ/аллиина в хроматограмме стандарта;

V - объем полученного депротеинизированного экстракта таблеток, мл;

Результаты и их обсуждение. В вышеописанных условиях хроматографии (рис. 2 и 3) ФТК - S-АЦ имеет время удерживания 6.5 – 6.6 мин, а аллиин 5.1-5.2 мин, в аналогичных условиях ФТК- производные свободных аминокислот не совпадают с временем выхода S-АЦ и аллиина (например аспарагиновая и глутаминовая кислоты соответственно 2.6 и 3.4 мин, серин и глицин 7.8 и 8.3 мин). Время удерживания S-АЦ и аллиина находятся между пиками глутаминовой кислоты и серина, что не мешает определению S-АЦ и аллиина в присутствии свободных аминокислот. Идентификацию и количественное определение S-АЦ в сыром чесноке, в дегидратированных субстанциях и в готовых таблетках также проводили в виде ФТК-производного. Так как свободные аминогруппы пептидов и белков связывают фенилизотиоцианат и уменьшают эффективность реакции, их перед получением ФТК-производного удаляли из анализируемых объектов путем экстракции в  депротеинизирующих условиях. Как видно из рис.4, главные компоненты в депротеинизированном экстракте чеснока представлены пиками, соответствующими S-АЦ и аллиину. Профиль хроматограммы ФТК-производных депротеинизированных субстанций чеснока и таблеток на их основе также были близки. Данные по количественному определению S-АЦ и аллиина представленны в таблице. При сравнении содержания исследуемых компонентов оказалось, что количество аллиина и S-АЦ в дегидратированном порошке существенно зависит от способа сушки.

Рисунок 2. ВЭЖХ ФТК-производного S-аллилцистеина (S-АЦ). Во встроенной рамке приведены данные интегрирования

Рисунок 3. ВЭЖХ ФТК-производного аллиина

Во встроенной рамке приведены данные интегрирования.

Так, при тщательном высушивании чеснок теряет 40-45% влаги и ожидаемые количества аллиина и S-АЦ в дегидратированном образце должны составлять 1.5% и 0.15% соответственно. Субстанция 1 содержит приблизительно два раза меньшее количество аллиина от ожидаемого и 4 раза меньшее количество S-АЦ.

Рисунок 4. ВЭЖХ ФТК-производного депротеинизированного экстракта долек сырого чеснока

Во встроенной рамке приведены данные интегрирования.

Уменьшение компонентов можно объяснить их потерей при обработке горячей водой. Наиболее близкие к ожидаемым показателям по содержанию исследуемых компонентов получены в случае, когда дегидратированный порошок получен немедленным замораживанием измельченного чеснока жидким азотом с последующей лиофильной сушкой. Другая закономерность наблюдается при сравнении количества испытуемых компонентов в готовых таблетках, полученных из субстанций, приготовленных двумя способами. Так, содержание аллиина в обоих типах таблеток составлял 30-35% от ожидаемых значений (исходя из содержания аллиина в использованной субстанции). Содержание  S-АЦ в таблетках из субстанции 1 (предварительно обработанная горячей водой) составлял около 30%, в то время как в таблетках из субстанции 2 (замораживание азотом и лиофильная сушка) около 15%. Такая существенная разница объясняется тем, что в данной субстанции, в отличие от термообработанной субстанции, сохраняются ферменты метаболизирующие S-АЦ. В процессе получения таблеток нативные ферменты могут уменьшить содержание S-АЦ, которое попадает в таблетки. 

Таблица 1.

Количественное определение S-аллилцистеина и аллиина в субстанции и таблетках чеснока и в исходном сырье

Заключение: Таким образом, результаты данной работы подтверждают возможность использования количественного определения аллиина и S-аллилцистеина с помощью ВЭЖХ путем их предколоночной модификации фенилизотиоцианатом для стандартизации таблеток чеснока.

Список литературы:

1. Al-Dulimyi, E.M.K., Abid, F.M., Abid Al-Gani, M.J., 2013. Determination of active ingredients (Alliin & Allicin) in different species of garlic gxtracts by using high performance liquid chromatography. Dyala J. Pure Sci. 9, 70–81.
2. Amagase, H., Petesch, B.L., Matsuura, H., Kasuga, S., Itakura, Y., 2001. Recent advances on the nutritional effects associated with the use of garlic as a supplement intake of garlic and its bioactive components. J. Nutr. 131, 955–962
3. Alizaden R. Theoretical study of structure, stability and infrared spectra of hydrogen bonding complexes pairing N-nitrosodietanolamine and one to five water molecules / R. Alizaden, N. M. Najafi // Journal of Structural Chemistry. – 2008. – Vol. 49, № 4 – С. 649 – 654.
4. Стрельникова О. Ю. Исследование концентрационных зависимостей и энергий активации молярных электропроводностей водных растворов аминокислот / О. Ю. Стрельникова, И. В. Аристов // Труды молодых ученых. – 2000. – № 2. – С. 92 – 95.
5. Yoo M.Y. Lee S.H. Validation of high performance lipid chromatography methods for determination of bioactive sulfur compounds in garlic bulbs, Food Science and Biotechnology, 2010, vol. 19 (pg. 1619-1626).