Оптимизация условий культивирования местных штаммов азотфиксирующих цианобактерий рода Nostoc

АННОТАЦИЯ

При массовой культуре водорослей интенсификация процесса биосинтеза может быть достигнута за счет создания высокой напряженности основных факторов, обусловливающих в автотрофных условиях высокую продуктивность фотосинтеза и накопление биомассы. К таким факторам прежде всего относятся температура, свет, углекислый газ (СО₂) и минеральное питание.  В данной работе установлены оптимальные параметры (температура, показатели рН среды, интенсивность света и концентрации СО₂) роста и развития местных штаммов цианобактерий рода Nostoc.  Полученные данные свидетельствуют о том, что в период роста местных штаммов цианобактерий рода Nostoc при температуре 28°С скорость накопления биомассы у штаммов было выше, чем при 24°С и 36°С. Оптимальное развитие и накопление биомассы культур выявлено при рН среды 7,5 и освещенности 3000 лк.  Выявлено, что для оптимального роста и развития цианобактерий необходимая концентрация СО₂ составляет 2%. Увеличение концентрации СО₂ до 2,5% приводит к снижению роста цианобактерий, по отношению к 2%.

ABSTRACT

In the case of algae mass cultivation, the intensification of the biosynthesis process can be achieved by creating a high intensity of the main factors that determine the high productivity of photosynthesis and the biomass accumulation in autotrophic conditions. These factors primarily include temperature, light, carbon dioxide (CO₂) and mineral nutrition. In this work, the optimal parameters (temperature, pH of the medium, light intensity and CO₂ concentration) of the growth and development of local cyanobacteria strains of the genus Nostoc have been established. The data obtained indicate that during the growth of local cyanobacteria strains of the genus Nostoc at the temperature of 28 °C, the rate of biomass accumulation in the strains was higher than at 24 °C and 36 °C. The optimal development and accumulation of culture biomass was found at the pH of 7.5 and illumination of 3000 lux. It was found that for optimal growth and development of cyanobacteria, the required concentration of CO₂ is 2%. An increase in the concentration of CO₂ up to 2.5% leads to a decrease in the growth of cyanobacteria, in relation to 2%.

Ключевые слова: цианобактерии, Nostoc, оптимизация, питательная среда, температура, свет, СО_2, биомасса

Keywords: cyanobacteria, Nostoc, optimization, nutrient medium, temperature, light, CO₂, biomass

Цианобактерии – прокариоты, осуществляющие оксигенный фотосинтез, и превращающие СО₂ в органическую биомассу с помощью фотосинтеза. Цианобактерии имеют замечательную метаболическую гибкость для адаптации и развиваются в различных экологических нишах, а оптимальные условия культивирования цианобактерий отличаются разнообразием среди рода, вида и штаммов [1-3]. Как и другие бактерии, цианобактерии имеют четыре фазы роста: лаг фаза, экспоненциальная или лог фаза, стационарная фаза и фаза смерти (латентная) [4]. Скорость роста может зависеть от удвоения клеток (период времени, необходимого для удвоения количества клеток или биомассы). Скорость роста можно определить путем подсчета клеток или изменением общей биомассы, а также может быть измерена косвенно с помощью изменения клеточных компонентов, таких как общий органический углерод, липиды, белки, или хлорофилла [5].

Для того, чтобы успешно культивировать цианобактерии в лабораторных условиях должны быть приняты во внимание различные экологические и питательные параметры. Наиболее часто изучаются такие параметры роста цианобактерий, как, качество и количество света, рН, засоление, температура и макроэлементы, в основном количество азота и фосфора. Свет является основным источником энергии для цианобактерий, качество и количество света сильно влияют на эффективность фотосинтеза [6].

Оптимизация условий культивирования, необходимых для усиления  роста водорослей, может смягчить производственные затраты и значительно улучшить экономику процесса. Таким образом, выбор быстрорастущих, продуктивных штаммов цианобактерий имеет принципиальное значение для успешного использования биомассы фототрофных микроорганизмов, так как с точки зрения прикладного использования, цианобактерии эффективны и технологичны, и обладают высокой скоростью роста, не требуют дорогого процесса культивирования (оборудования и питательных сред). Известно, что цианобактерии являются источниками биологически активных соединений, которые могут применяться в пищевой продукции, медицине, сельском хозяйстве [7].

Исходя из вышесказанного целью исследований является оптимизация условий культивирования (температура, рН среды, интенсивность света и концентрации СО₂) местных штаммов цианобактерий рода Nostoc на безазотной минеральной среде BG₀-11 для получения наибольшей биомассы культур.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования

Объектом исследований являлись местные штаммы азотфиксирующих цианобактерий рода Nostoc: N. linckia 4, N. muscorum 14, N.pruniforme 20, N. calcicola 25 выделенные из засоленных и загрязненных пестицидами сероземных почв Кашкадарьинской, Наманганской и Сырдарьинской областей Узбекистана [8,9].

Оптимизация условий культивирования

Оптимизация условий культивирования на среде ВG -11₀ местных штаммов цианобактерий проводилась при различной температуре (24 ^оС, 28 ^оС, 30 ^оС, 32 ^оС, 36 ^оС), рН (6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5), освещeнности (1000, 2000, 3000, 4000 люкс) и концентрации СО₂ (0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%) в течение 10 сут выращивания. При данных условиях выращивания было определено образование биомассы культурами цианобактерий [10].

Культивирование цианобактерий

Жидкую среду ВG -11₀ наливали в стеклянные колбы (300 – 500 мл) таким образом, чтобы занимаемый объем был не более ¹/₃ – ¹/₄ объема колбы. Сосуды с засеянным материалом помещали на свет с люминесцентными лампами, при различной освещенности, температуры и концентрации СО₂.

В установлении достоверности результатов опытов при подсчёте линейного отклонения, среднего отклонения, при подсчёте интервалов достоверности использован t-критерий Стъюдента и компьютерные программы STATISTICA 6.0.

Определение сухого веса (влажности) биомассы клеток цианобактерий

Определение сухого веса биомассы клеток проводилось согласно методике [11]. Стеклянные бюксы помещались в сушильный шкаф и сушились в течение 2 ч при температуре 110°С. Затем бюксы вынимали пинцетом из сушильного шкафа и переносили в эксикатор с безводным CaCl₂. Через 1 ч бюксы взвешивали с точностью до 0,1 мг. Высушивание и взвешивание повторяли с соблюдением указанной последовательности операций, пока масса не достигала постоянного значения, то есть колебания в ее определениях не превышали ± 0,1 мг.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследуемые азотфиксирующие культуры N. linckia 4, N. muscorum 14, N.pruniforme 20, N. calcicola 25 были выделены в основном в весенне-летние периоды из почвенных и ризоферных образцов растений (Рис.1.а,б,в.г) [8,9]. В весенний период средняя температура в Республике Узбекистан составляет 20-26 ^оС, летом - 38-40 ^оС, а рН почвы находится в пределах 8,0-8,5. Исходя из этих данных, при оптимизации условий культивирования цианобактерии выращивали при температуре в интервале от 24 до 36 ^оС и показатели активности рН среды составляла от 6,0 и 8,5.

Рисунок 1. Микроскопические фотографии местных штаммов цианобактерий рода Nostoc:

 а – N. linckia 4; б –N. muscorum 14; в – N.pruniforme 20; г – N. calcicola 25. (Увеличение: 100 х 13,5)

Полученные данные свидетельствуют о том, что в период роста цианобактерий при температуре 28°С скорость накопления биомассы у исследуемых штаммов было выше, чем при 24°С и 36°С (табл. 1). Следует отметить, что у эффективного штамма Nostoc calcicola 25 образование биомассы при 28°С увеличивается примерно на 30% и 33,2% по сравнению с биомассой образовавшейся при 24°С и 36°С, соответственно.

Оптимальное развитие и накопление биомассы культур выявлено при рН среды 7,5. Сдвиг рН среды культивирования в кислую (6,0) или в щелочную (8,5) сторону от оптимальных условий (рН 7,5) приводит к уменьшению накопления биомассы (табл. 2). Стабилизация рН среды в диапазоне оптимальных значений является необходимым условием для получения воспроизводимых характеристик водорослей. Стратегия оптимального выращивания водорослей определяется кинетикой роста, накоплением продуктов и поглощением субстрата [12].  В работе Touloupakis et al., (2016) для оценки показателей роста культуры

Таблица 1.

Влияние температуры на рост и развитие местных штаммов цианобактерий

Примечание: * - статистически значимо при р≤0,05

Synechocystis PCC 6803 выращивали при разных значениях рН в непрерывных условиях. Установлено, что как фотосинтетическая активность, так и скорость фотосинтеза не изменяются при рН от 7,5 до 11,0, тогда как при рН 11,0 выход биомассы снижается на 26% [13]. Биохимический состав биомассы практически не изменяется в пределах рН от 7 до 10, тогда как при рН 11,0 содержание углеводов увеличивается на 33%.

Исследования по изучению влияния интенсивности света на рост и развитие отобранных штаммов цианобактерий показали, что для оптимального роста и развития культур необходимо интенсивность освещенности в пределах 2500 - 3500 лк. Следует отметить, освещенность 3000 лк обеспечивает максимальное накопление биомассы цианобактерий. Так, у эффективных штаммов Nostoc pruniforme 20 и Nostoc calcicola 25, при интенсивности освещенности 3000 лк сухой вес биомассы составлял 0,998 г/л и 1,26 г/л, соответственно.

Таблица 2..

Влияние рН среды на рост и развитие местных штаммов цианобактерий

Примечание: * - статистически значимо при р≤0,05

Известно, что интенсивность света является важным параметром при выращивании цианобактерий. Высокие значения интенсивности света способствуют некоторым параметрам роста культур, таким как максимальная удельная скорость роста, в то же время, как низкие значения приводят к биомассе, богатой пигментами и белком [14,15]. Отмечено, что     Synechocystis sp. PCC 6803 относительно легко культивируется в лабораторных условиях, и используется в качестве модельного штамма для изучения различных механизмов фотосинтеза. Synechocystis sp. PCC 6803 используют разные составы фотопигментов для захвата доступного солнечного света, присутствующего в конкретной экологической нише [13,16].

В следующих опытах местные штаммы цианобактерий выращивали при подаче различных концентраций СО₂. Как видно из таблицы 3 для оптимального роста и развития цианобактерий необходимая концентрация СО₂ составляет 2%. Увеличение концентрации СО₂ до 2,5% приводит к снижению роста цианобактерий, по отношению к 2%. Например, при достижении концентрации СО₂ - 2,5%, у культур Nostoc pruniforme 20 и Nostoc calcicola 25 эффективность образования биомассы снижается на 26,3% и 31,4%, соответственно по отношению концентрации СО₂ – 2%.   

Таблица 3.

Влияние различных концентраций CO₂ на рост и развитие местных штаммов цианобактерий

Примечание: * - статистически значимо при р≤0,05

Lu et al., (2006) в течение 12 дней изучали физиологические ответы цианобактерий при атмосферных концентрациях СО₂ – 0,035, 0,06 и 0,08% в периодических культурах фикоцианин - богатого штамма (ФЦ) и фикоэритрин - богатого штамма (ФЭ) рода Synechococcus в периодах 12 - час световой режим : 12 - час темный режим. За это время изучали физиологические изменения пигментов фикоцианина и фикоэритрина у цианобактерий.

При этом, они обнаружили, что рост и развитие ФЭ штамма не зависело от увеличения концентрации СО₂. При исследовании же ФЦ штамма выявлено, что при концентрации СО₂ 0,08% наблюдается увеличение роста культуры на 36,7% по сравнению с вариантом, где содержание СО₂ составляло 0,035% [18]. Также в исследованиях Hutchins et al., (2007); Levitan et al., (2007), (2010); Ramos et al., (2007) и Garcia et al., (2011) показано значительное увеличение азотфиксации и фотосинтеза у диазотрофных морских цианобактерий Trichodesmium в ответ на повышение концентрации СО₂. Следовательно, они приходят к выводу, что антропогенное обогащение атмосферы CO₂ может существенно увеличить глобальную океаническую фиксацию N₂ и CO₂ и это положительное явление имеет огромное значение для морской биосферы [19-22].

Известно, что меняя различные параметры роста культур цианобактерий, можно получать различные целевые вещества в процессе выращивания (например, пигменты, каротиноиды, жирные кислоты, наибольшую биомассу). Таким образом, особый интерес вызывает подбор условий культивирования для получения биомассы микроводорослей с повышенным содержанием биологически ценных веществ. Рост и развитие цианобактерий, а также накопление биомассы существенным образом зависят от температуры, интенсивности света и активной реакции среды - рН.

Список литературы:

1. Singh D. P. “Some secrets of ubiquity in cyanobacteria,” inAlgal Biology and Biotechnology eds Khattat J. I. S., Singh D. P., Kaur G., editors.India: I.K. International Publishing House Pvt. Ltd. 2009. P.57–62.
2. Singh J.S., Strong P.J. Biologically derived fertilizer: a multifaceted bio-tool in methane mitigation.Ecotoxicol. Environ. Saf. 2016. V.124. P.267–276.
3. Rahmonov O, Piątek J. Sand colonization and initiation of soil development by cyanobacteria and algae. Ekológia (Bratislava). 2007. V.26. N.1. P.52-63.
4. Wood A.M., Everroad R.C., Wingard L.M. “Measuring growth rate in microalgal cultures,” in Algal Culturing Techniques/ ed. Anderson R. A., editor UK: Elsevier Academic Press. 2005. P.269–288.
5. Moheimani N. R., Borowitzka M. A., Isdepsky A. “Standard methods for measuring growth of Algae and their composition,” in Algae for Biofuels and Energy eds Borowitzka M. A., Moheimani N. R., editors. (Dordrecht: Springer). 2013. P.265–283.
6. Bibby T. S., Zhang Y., Chen M. Biogeography of photosynthetic light-harvesting genes in marina phytoplankton.PLoS ONE4. 2009. e.4601.
7. Дидович С.В., Москаленко С.В., Темралеева А.Д., Хапчаева С.А. Биотехнологический потенциал почвенных цианобактерий (обзор) // Вопросы современной альгологии. 2017. № 2 (14).
8. Кадырова Г.Х. Таксономия и некоторые свойства местных азотфиксирующих цианобактерий рода Nostoc // Доклады АН РУз.-Ташкент, 2012. - №1. -С.71-75.
9. Kadirova G.Kh., Z.S.Shakirov Identification of nitrogen-fixing and salt-resistant cyanobacteria Nostoc calcicola isolated from the rhizosphere of cotton in Uzbekistan // Environmental Science An Indian Journal, 2012. – Vol. 7, Issue 8. - Р.305-309.
10. Stanier R.Y., Kunisawa R., Mandel M., Cohen-Bazire G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order  Chroococcales).Bacterial Rev. 1971. V.35. N.2. –P. 171-205.
11. Пименова М. Н., Гречушкина Н. Н., Азова Л. Г., Нетрусов А. И., Семенова Е. В., Колотилова Н. Н., Захарчук Л. М., Зинченко В. В., Мыльникова С. И., Нефедова М. В., Ботвинко И. В. Руководство к практическим занятиям по микробиологии [Текст] / Под ред. Егорова Н.С. – М.: Изд. МГУ. – 1995. – 224 с.
12. Sinha R.P., Gröniger A., Klisch M., Häder D.P. Ultraviolet-B radiation: photoprotection and repair in aquatic organisms. Recent Res. Devel. Photochem. Photobiol. 2002. V.6. –P.107-119.
13. Touloupakis E, Cicchi B, Benavides AMS, Torzillo G. Effect of high pH on growth of Synechocystis sp. PCC 6803 cultures and their contamination by golden algae (Poterioochromonas sp.). Appl Microbiol Biotechnol. 2016 Feb;100(3):1333-1341.
14. Markou G. Effect of Various Colors of Light-Emitting Diodes (LEDs) on the Biomass Composition of Arthrospira platensis Cultivated in Semi-continuous. Mode Applied Biochemistry and Biotechnology. Appl Biochem Biotechnol. 2014 Mar;172(5):2758-68.
15. Roberta Ferreira Rizzо, Beatriz do Nascimento Corrêia dos Santоs, Gabriela Fernandes Pepe da Silva de Castrо, Thaís Souza Passоs, Manuela de Abreu Nascimentо, Hevelyn Dantas Guerra, Carla Guidone da Silva, Daiana da Silva Dias, Josiane Roberto Dоmingues, Kátia Gomes de Lima-Araújо Production of phycobiliproteins by Arthrospira platensis under different light conditions for application in food products. Food Sci. Technol, Campinas, 35(2): 247-252.
16. Chen M., Scheer H. Expanding the limits of natural photosynthesis and implications for technical light harvesting. J. Porphyrins Phthalocyanines. -2013.(17). –P.1–15.
17. Hou X., Raposo A., Hou H. J. Response of chlorophyll d-containing cyanobacterium Acaryochloris marina to UV and visible irradiations. Photosynth Res. 2013 Nov;117(1-3):497-507.
18. Lu Z., Jiao N, Zhang H. Physiological changes in marine picocyanobacterial Synechococcus strains exposed to elevated CO2 partial pressure.Marine Biology Research. 2006. P.424-430.
19. Hutchins D.A., Fu F.X., Zhang Y., Warner M.E., Feng Y., Portune K., Bernhardt P.W., Mulholland M.R. CO2 control of Trichodesmium N-2 fixation, photosynthesis, growth rates, and elemental ratios: implications for past, present, and future ocean biogeochemistry. Limnology and Oceanography, 52(4), 1293-1304.
20. Levitan O., Rosenberg G., Setlik I., Setlikova E., Grigel J., Klepetar J., Prasil O., Berman-Frank I. Elevated CO(2) enhances nitrogen fixation and growth in the marine cyanobacterium Trichodesmium. Glob Change Biol. -2007;13:531–538.
21. Levitan O., Sudhaus S., LaRoche J., Berman-Frank I. The influence of pCO (2) and temperature on gene expression of carbon and nitrogen pathways in Trichodesmium IMS101.PLoS ONE. 2010;5:e15104.
22. Garcia NS, Fu FX, Breene CL, Bernhardt PW, Mulholland MR, Sohm JA, Hutchins DA. Interactive effects of irradiance and CO2 on CO2 fixation and N2 fixation in the diazotroph Trichodesmium erythraeum (CYANOBACTERIA)(1). J Phycol. 2011 Dec;47(6):1292-1303.