Выделение, очистка фермента инулиназы из растения Hellanthus tuberosus L. и изучение его физико-химических и кинетических свойств

АННОТАЦИЯ

В данной научной работе приведены результаты исследований по разработке оптимальных условий выделения инулиназы из клубней топинамбура (Helianthus tuberosus). Выявлен наиболее эффективный экстрагент, способствующий максимальному переходу белков в раствор, осуществлено концентрирование экстракта растворимого белка с полным сохранением его ферментативной активности. При мацерации кислород мезги вытесняется газом СО₂.  Данное направление исследования клеточных инулиназ является весьма актуальным при переработке клубней на сиропы, функциональные пищевые продукты, биологически активные добавки и при производстве кристаллической фруктозы из местных сортов топинамбура.

ABSTRACT

This scientific work presents the results of research on the development of optimal conditions for the release of inulinase from Jerusalem artichoke tubers (Helianthus tuberosus). The most effective extractant, which promotes the maximum transfer of proteins into solution, has been identified, and the extract of soluble protein has been concentrated with full preservation of its enzymatic activity. During maceration, oxygen in the pulp is displaced by CO2 gas. This line of research on cellular inulinases is very relevant in the processing of tubers into syrups, functional foods, biologically active additives and in the production of crystalline fructose from local varieties of Jerusalem artichoke.

Ключевые слова: Инулиназа, hellanthus tuberosus l, сорт «Мужиза», сорт «Файз барака», фруктоза

Keywords: hellanthus tuberosus l, inulinase, mujiza, fayz Baraka, fructoza.

Введение

Все ферменты имеют специфическую структуру и требуют условий для проведения каталитических реакций. В последние десятилетия одной из развивающихся наукоёмких отраслей современного производства различных пищевых продуктов, лекарственных средств и кормов из топинамбура является биотехнология. Существенно расширены исследования по производству различных целевых продуктов из клубней топинамбура. Однако, эти способы имеют ряд недостатков. Гидролиз фруктанов осуществляется в кислой среде при высокотемпературном режиме производства, СВЧ для инактивации окислительных ферментов. Гидролиз инулина осуществляют коммерческими ферментными препаратами, что связано с расходом инвалюты.

Известно, что инулазы могут синтезироваться различными микроорганизмами (микомицетами, дрожжами и бактериями). Ферменты, выделенные из токсикогенных микроорганизмов, являются экологически опасными для пищевой промышленности, т.к. при производстве коммерческих ферментных препаратов без очистки ферментного белка до гомогенного состояния с ним соосаждаются микотоксины, окислительные ферменты. Попадая в пищевые продукты, они нарушают безопасность биологически активных ингредиентов топинамбура. Безопасными являются микроорганизмы, используемые в пищевой промышленности [1-3].

Самым перспективным с позиции максимального использования сырья является низкотемпературное самоосахаривание инулина инулиназой клубней, которое является актуальной проблемой современной биотехнологии переработки клубней топинамбура.

Одним из направлений исследования инулиназ, выделенных из клубней, является возможность их активизации в условиях переработки клубней на целевые продукты. По имеющимся в литературе данным исследования в данном направлении не проводились.

Цель данной работы - выделение, очистка ферментного белка, изучение физико-химических свойств инулиназ клубней и их кинетических показателей.

Инулиназа расщепляет инулин и другие фруктаны до фруктозы, она широко распространена среди высших растений и микроорганизмов.  Микробные источники инулиназы достаточно хорошо исследованы. Однако, недостаточно сведений по выделению и очистке инулиназ из клубней топинамбура, а также сохранению её активности в процессе получения целевых веществ как основы для производства функциональных пищевых продуктов и медицинских средств. При производстве целевых продуктов из клубней топинамбура, порошка, сиропа, кристаллической фруктозы, этанола учеными Шахрисабзского филиала Ташкентского химико-технологического института были разработаны принципиально новые технологии, обеспечивающие сохранение инулиназы в целевых продуктах фракционного состава инулина.

Материалы и методы.

Исследованию подвергались местные сорта топинамбура «Мужиза» и «Файз барака», полученные из НИИ растениеводства. Опыты проводились на лабораторной базе института «Химии растительных веществ». Для проведения опытов в лабораторных условиях клубни очищались от кожуры, измельчались до гомогенного состояния путем двукратного замораживания-оттаивания для достижения максимального разрушения клеточной структуры до гомогенной массы.

Экстракцию проводили с 0,1М ацетатным буфером рН 5,0 с дальнейшим центрифугированием и осаждением супернатанта сульфатом аммония (NH₃)₂SO₄ до 65% насыщения и последующим отделением белков центрифугированием. Обессоливание и частичную очистку фермента осуществляли гель фильтрацией на Сефадуксе G-100, далее электрофоретически определяли молекулярную массу полученных белков [4-5].

Молекулярная масса I фракции белков составила 115 кДа, второй фракции II – 67кДа, третьей фракции III – 39 кДа. Гидролитическую активность белков определяли по методике [4-5]. Образовавшиеся продукты гидролиза фруктана определяли рН-метрическим методом, глюкозу определяли по методике Афанасьева Г.А. [4-5;]. За единицу активности инулиназы принимали такое количество фермента, который катализирует 1 мМ фруктана за 1 минуту при 50^оС в 0,05М растворе ацетатного буфера при рН 4,5, содержащим 1% раствор инулина. Выход активного белка после 4-х стадийной обработки составил 14,2%, выделены фракции инулиназ с выходом 6,7% (I); 4,6% (II); фракция III активного белка не обладала гидролитической активностью [6-10].

В разработанных технологиях производства целевых продуктов из клубней топинамбура предусмотрена, очистка клубней от кожуры «взрывным» способом, за счет перепада давления острого пара Р=0,35 МПа путем мгновенного сброса давления, которое осуществляется в течении 4-5 мин. Происходит одновременная инактивация окислительных ферментов клубней и стерилизации их поверхности.

Кроме того, используется способ мацерации мезги под давлением газа СО₂ Р=0,50 МПа с мгновенным сбросом давления газа. Избыточное давление газа (пара) при мгновенном сбросе давления разрывает клеточную структуру измельченных клубней с увеличением выхода сока, повышением экстрактивности. Клеточный фермент инулиназа переходит из связанного состояния в свободное в течение 5 мин. мацерации мезги. Выполнение всех этих усло0вий при производстве целевых продуктов увеличивает выход инулиназ и их стабильность. Гидролитическая активность инулиназы, полученная для 1% раствора инулина и рассчитанная по составляет Vmax=60 мг/мин и за 1 час доходит до 2,40 г/час. что свидетельствует о высокой активности  инулиназ клубней. Между тем следует заметить, что практическое использование препаратов инулиназы предполагает значительные расходы фермента связанные затратами инвалюты.

Кинетические параметры ферментативного гидролиза инулина изучали [3; 11 - 12] с помощью местной и иммобилизованной дрожжевой инвертазы (Sach. Cerevizia) (коммерческий препарат). Следует отметить, что инвертазу также называют фруктановой экзогидролазой (Verhacst M, 2005) и инулазой (Nagem R. 2004) из-за ее активности в отношении содержащих фруктозу углеводов, в частности, стахиозы рафинозы и инулина. В результате наших исследований были определены основные характеристики локально иммобилизованной дрожжевой инвертазы - субстрата инулина.

Таблица 1.

Основные характеристики инвертазы

Таким образом, исследования автора [4, 12] показали, что фермент инвертаза обладает низкой стабильностью, что можно объяснить специфичностью инвертазы к сахарозе. Будучи фруктоэкзогидролазой, дрожжевая инвертаза в отсутствии эндофункции не способна гидролизовать высокомолекулярный инулин. Кроме того, автор не вносил в реакционную среду активирующий инулиназу ион Са⁺² и не проводил брожения с дрожжами на инулинсодержащий среде, в этих условиях дрожжи (Sach. cerevizia) обладают свойством адаптации к углеводам среды путем биосинтеза экзо- и эндо- фруктаногидролазы [4-5].

Инулиназы являются промышленно важными ферментами, так как с их помощью можно проводить гидролиз в низкотемпературном режиме с сохранением биологически активных ингредиентов клубней топинамбура, что очень важно при производстве биологически активных добавок как основы функциональных пищевых продуктов и лекарственных средств. В настоящее время путем сочетания разнообразных методов получены мульти- препараты инулиназ с высокой степенью очистки. [5, 7]. Однако, очень мало работ, посвященных изучению растительных инулиназ, в частности, естественного фермента клубней топинамбура.

В диссертации Холявка М.Г. [11, 12] проведены сравнительные исследования инулиназы дрожжей Kluyveromyces marxianus V-303 и клубней топинамбура. Получен препарат дрожжей, очищенный в 39,8 раз, при выходе фермента 13,5% и инулиназы клубней топинамбура. После 4-х стадий очистки выделены 3 фракции фермента инулиназ с выходом: 5,4% (I); 3,1% (II); 1,9% (III). Ферменты растительного происхождения характеризовались следующими оптимумами функционирования: t=48^oC; pH 6,8 (I); t=39^oC pH 6,2 (II); t=40^oC pH 4,5 (III). Каталитические свойства инулиназ: при максимальной скорости процесса гидролиза для дрожжей была, для фракции инулиназ клубней степень очистки до гомогенного состояния и выход фермента были соответственно равны: 55,7 и 5,4% (I); 28,9 и 3,1% (II); 21,6 и 1,9% (III). Очищенные клеточные ферменты теряют свои эффекторы и индукторы, которые имеются в клеточном соке, о чем свидетельствуют данные авторов [1-5]. Vmax=90,91 (I); 47,62 (II); 37,04 (III) для неочищенного фермента. Суммарная активность I и II фракции, проявляющаяся почти в одинаковых значениях рН 6,8-6,2, Vmax составляет 137,5 мг/мин. При самоосахаривании фруктанов клубней используются естественные инулиназы клубней с их высокой степенью активности, и Vmax в этом случае будет превышать активность дрожжей. Перспективным является выделение экстрацеллюлярных, высокоспецифичных инулиназ из бактерий в связи с тем, что биосинтез бактериальных инулиназ мало изучен. Исследованиями Абрамовой И.Н [3, 8] впервые изучены особенности синтеза внеклеточной инулиназы некоторыми штаммами бактерий в глубинных условиях культивирования. Максимальная активность проявлялась при рН 7,0, температуре – 40^оС выделен гомогенный препарат инулазы с активностью 534 ед/мг белка, молекулярная масса 90 гр./мол. Наиболее перспективный способ – ферментативный гидролиз инулина естественными ферментами инулиназ клубней. Согласно данным Крикуновой Л.Н. и др [6] установлено, что при обработке водной смеси измельченных клубней с внесением для активации инулиназ клубней ионов Са⁺² при естественном рН среды в пробах, выдержанных при t=50-60^oC, накапливалось максимальное количество свободных сахаров (30-33%), что составляет 40% от общего содержания фруктанов в топинамбуре, остальное - 40-42% инулина, автор проводит гидролиз с использованием коммерческих ферментных препаратов протеазы и цитазы до остаточного содержания фруктанов 3-5%. Критический анализ литературы по биосинтезу инулиназ различными микроорганизмами не может конкурировать с использованием в процессе переработки клубней самоосахаривания за счет естественных инулиназ клубней. Этим будет обеспечено решение экологических проблем, снижение себестоимости целевых продуктов и их высокое качество.

Результаты и обсуждение.

При экспериментальном исследовании физико-химических и кинетических свойств инулиназы клубней установлено, что использование инулиназы клубней в процессе производства целевых продуктов в нативном состоянии с учетом оптимальных условий действия фермента с добавлением активатора 0,01% СaSO₄ и соответствующих условий среды (рН и температуры), экономически целесообразно и безопасно для потребителей» используется для инулиназы клубней.

В данной научной работе используется новый подход, основанный на разрыве клеточной структуры и координационных связей и переход клеточной связанной инулиназы и инулина из связанного состояния в свободное активное состояние путем мацерации мезги под давлением диоксида углерода и моментальным сбросом давления. При мацерации кислород мезги вытесняется газом СО₂. В условиях насыщения сока углекислым газом предотвращается окислительная трансформация ферментов и витаминов и др. биологически активных веществ. При перепаде давления происходит расщепление цепочки инулина до низкомолекулярных фруктанов. Таким образом, наиболее перспективный способ – ферментативный гидролиз инулина, который может быть осуществлен под действием собственных инулиназ. Данное направление исследования клеточных инулиназ является весьма актуальным при переработке клубней на сиропы, функциональные пищевые продукты, биологически активные добавки и при производстве кристаллической фруктозы из местных сортов топинамбура.

Выводы.

Таким образом, исследование физико-химических свойств и гидролитической активности дает возможность считать использование нативного фермента клубней в производстве целевых продуктов без внесения ферментных препаратов выделенных из токсикогенных микроорганизмов, что повысит эффективность, экологическую безопасность, энерго- и ресурсосбережение, упростит технологии производства целевых продуктов из уникального, нового углеводного сырья Узбекистана. Работа по данной теме продолжается.

Список литературы:

1. Аманова М., Мавлянова Р., Рустамов А. Топинамбур экини уруғчилиги бўйича тавсиянома Ўзбекистон Фанлар академияси. Т.: Фан. 2011. 21б.
2. Квитайло И.В., Кожухова М.А., Степуро М.В. Сравнительный биохимический анализ клубней топинамбура различных сортов. // Известие вузов, пищевая технология, №2,3, 2010-с.20-21.
3. Кривицкая Е.Н. Перспективное использование порошка топинамбура для профилактики органов пищеварения. //Будь здоров, 1999, №1-С.12 13.
4. Мавлянова Р.Д. Қанд лавлаги етиштириш агротехникаси. Тошкент, 1995.-12б.
5. Contreras-Hernández, M. G., Ochoa-Martínez, L. A., Rutiaga-Quiñones, J. G., Rocha-Guzmán, N. E., Lara-Ceniceros, T. E., Contreras-Esquivel, J. C., et al. (2018). Effect of ultrasound pre-treatment on the physicochemical composition of Agave durangensis leaves and potential enzyme production. Bioresour. Technol. 249, 439–446. doi: 10.1016/j.biortech.2017.10.009
6. Rubel, I. A., Iraporda, C., Novosad, R., Cabrera, F. A., Genovese, D. B., and Manrique, G. D. (2018). Inulin rich carbohydrates extraction from Jerusalem artichoke (Helianthus tuberosus L.) tubers and application of different drying methods. Food Res. Int. 103, 226–233. doi: 10.1016/j.foodres.2017.10.041
7. Wang, Z., Hwang, S. H., Lee, S. Y., and Lim, S. S. (2016). Fermentation of purple Jerusalem artichoke extract to improve the α-glucosidase inhibitory effect in vitro and ameliorate blood glucose in db/db mice. Nutr. Res. Pract. 10, 282–287. doi: 10.4162/nrp.2016.10.3.282
8. Самсонова В.А., Покровский А.М. Справочник по диетологии. – М.: Изд. Меридиан, 1992 – С. 13-18.
9. Френкель И.Д., Першин С.Б. Сахарный диабет и ожирение. М.: 1996. – 67 с.
10. Поташев Д.А. Лечение топинамбуром // Земля Сибирская, дальневосточная. – 1994 - №6, С. 12-13.
11. Van den Berghe G. Fructose: metabolism and short-term effects on carbohydrate and purine metabolic pathways. In: Macdonald I, Vrana A, eds. Metabolic effects of dietary carbohydrates. ProgBiochemPharmacol 1986;21:1-32.
12. Ziyan E., Pekyardimci S. Characterization of polyphenol oxidase from Jerusalem artichoke (Helanthus tuberosus). Turk. J. Chem., 27, p. 217-225, 2003.