Влияние некоторых танинов на митохондриальную мегапору печени крыс

АННОТАЦИЯ

В данном исследовании изучено влияние некоторых танинов на циклоспорин А (ЦсА)-чувствительную мегапору митохондрий печени крысы. Установлено, что ингибирование танинами, в частности Глюкопир Т и Ксилопир Т, приводит к конформационным изменениям митохондриальной мегапоры, вызванное 10 мкМ Са²⁺ в митохондриях печени крысы. Полумаксимальная концентрация ингибирования (IC₅₀) составляет для Глюкопир Т 42,2 ± 3,8 мкМ, а для Ксилопир Т – 101,7±3,1 мкМ.

ABSTRACT

In this study the effect of some tannins on cyclosporin A (CsA)-sensitive rat liver mitochondrial permeability transition pore (mPTP) was investigated. It was found that inhibition of the conformational change of mPTP by tannins, particularly Glucopyr T and Xylopyr T, caused by 10 μM of Ca²⁺ in rat liver mitochondria. The half-maximum inhibitory concentration was 42.2 + 3.8 μM for glucopyrite T and 101.7 + 3.1 μM for xylopyrine T.

Ключевые слова: митохондрии печени, мегапора, глутамат, малат, танины.

Keywords: liver mitochondria, mptp, glutamate, malate, tannins.

Регуляция свободного Ca²⁺ в митохондриях критически важна для клеточного гомеостаза [5, с. 795; 6, р. 1]. Митохондрии первично реагируют на окислительный стресс, приводя к развитию различных патологических состояний [10, р. 35]. При окислительном стрессе мегапора, расположенная на внутренней мембране митохондрий, переходит в открытое конформационное состояние, обеспечивая неспецифический вход с массой до 1,5 кДа веществ в матриксе митохондрий [9, р. 129]. То есть активность мегапоры, чувствительной к циклоспорину А (ЦсА) (РТР – permeability transition pore), которая зависит от ионов Сa²⁺, как полагают, спонтанно связана с апоптозом и/или некрозом животных клеток [4, с. 1261]. Открытие ЦсА-чувствительной мегапоры в митохондриях приводит к ее сильному набуханию, разрыву внешней мембраны, выбросу межмембранных компонентов в цитозоль клетки и стимулирует развитие апоптоза [2, с. 356]. Кроме того, в тканях нарушается антиоксидантно-прооксидантная система и развивается перекисное окисление липидов. Перекисное окисление липидов приводит к усилению многих патологических процессов [7, р. 118].

Учитывая вышеизложенное, в настоящее время важно выбрать потенциальные фармакологические соединения путем изучения клеточных и субклеточных механизмов действия биологически активных веществ, выделенных из растений. Среди биологически активных веществ особое место занимают полифенольные соединения, в том числе танины. Танины представляют собой широкий спектр биологически активных веществ и обладают антиоксидантными, антигипоксическими, антимикробными, противовирусными, противовоспалительными, мембранотропными и другими свойствами [3, с. 278; 17, p. 1]. Чтобы прояснить механизмы действия танинов на организм и создания новых лекарственных средств, очень важно изучить их действие на функции клеток и субклеточных структур.

Целью данного исследования явилось изучение влияния некоторых танинов, таких как Глюкопира Т [гексагидроксидифеноил-1-(ο-β-D-глюкопиранозид)-2-(ο-4-D-галлоил-β-D-глюкопиранозид)] и Ксилопира Т [гексагидроксидифеноил-1-(ο-2-ο-галлоил-β-D-глюкопиранозид)-1-(ο-β-D-ксилопиранозид)], выделенных из растений Plantago major L, на мегапоры митохондрий печени крысы.

Материалы и методы исследования. Исследование проводилось на белых беспородных крысах массой тела 180–200 г. Митохондрии печени крысы выделяли методом дифференциального центрифугирования по методу Шнайдера [14, p. 1–22]. Среда выделения содержала 250 мМ сахарозу, 1 мМ ЭДТА, 10мМ трис-HCl, pH 7,4. На первом этапе центрифугирование проводили при скорости 1500 об/мин в течение 7–8 минут. На втором этапе центрифугирование проводили в течение 15 минут при скорости 6000 об/мин. Суспензию митохондрий разбавляли в среде выделения без ЭДТА и хранили на льду. Концентрация белка в маточной суспензии составляла 75–90 мг/мл. Белок определяли по методу биурета [8, p. 751–766].

Состояние митохондриальной Ca²⁺-зависимой мегапоры оценивали по изменению оптической плотности суспензии митохондрий при длине волны 540 нм в кювете объемом 3,0 мл с интенсивным перемешиванием при температуре 26 °C и содержанием белка 0,3–0,4 мг/мл в среде инкубации. Среда инкубации содержала 120 мМ КCl, 5 мМ глутамат, 5 мМ малат, 1 мМ KН₂РO₄, 20 мкМ Ca²⁺-ЭГTA буфер, 20 мМ HEPES, 20 мМ трис-HCl, олигомицин – 1 мкг/мл, рН 7,2 [11, p. 1–7].

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программы Origin 6.1 с вычислением средней арифметической величины (М), стандартной ошибки (m) и показателя достоверности (р). Величину р < 0,05 рассматривали как показатель достоверных различий.

Результаты и их обсуждение. В экспериментах набухания митохондрий печени индуцировали 10 мкМ Сa²⁺, и этот процесс оценивали как открытие РТР. В экспериментах (рис. 1А) концентрация 10 мкМ танина Глюкопира Т ингибирует набухание митохондрий печени крысы на 17,3 ± 1,4 % относительно контроля. В этих условиях Глюкопир Т в концентрации 20 мкМ достоверно ингибировал скорость набухания митохондрий на 28,0 ± 2,1 % относительно контроля. Глюкопир Т в концентрациях 30 и 40 мкМ достоверно снижал скорость набухания митохондрий по сравнению с контролем на 40,1 ± 2,4 % и 47,8 ± 3,1 % соответственно. Более высокая концентрация этого танина 50 мкМ ингибировала набухание митохондрий на 56,3 ± 2,9 % относительно контроля. Из полученных данных видно, что это соединение ингибирует открытие мегапоры митохондрий, вызванное Сa²⁺, и приводит к стабилизации мембран митохондрий печени крыс. Увеличение концентрации исследуемого соединения в среде инкубации не приводило к дальнейшему ингибированию мегапоры митохондрий. IC₅₀ данного соединения составляет 42,2 ± 3,8 мкМ.

Следующее соединение Ксилопир Т в концентрации 50 мкМ ингибировало набухание митохондрии печени, индуцированного 10 мкМ Ca²⁺, на 31,4 ± 1,6 % относительно контроля. Концентрация этого полифенола 100 мкМ уменьшала набухание митохондрий печени на 48,8 ± 3,1 % относительно контроля. Было обнаружено, что концентрации 150 и 200 мкМ Ксилопира Т ингибирует Са²⁺-зависимое набухание митохондрий печени крысы на 65,4 ± 3,1 % и 72,3 ± 1,9 % соответственно (рис. 1Б). IC₅₀ составляет 101,7 ± 3,1 мкМ.

Рисунок 1. Влияние Глюкопира Т (А) и Ксилопира Т (Б) на Сa²⁺-зависимое набухание митохондрий печени крыс (* – Р < 0,05, ** – Р < 0,01, *** – Р < 0,001; n = 5), ЦсА – 10 мкМ

Полученные результаты показывают, что исследованные танины вызывают дозозависимое ингибирование Са²⁺-зависимого митохондриального мегапоры печени крысы. Было обнаружено, что эти таниновые полифенолы ингибируют митохондриальную мегапору и проявляют высокие антирадикальные свойства [1, c. 1; 12, p. 1022]. Они являются мощными антиоксидантами [15, p. 333; 13, p. 371]. Также показано, что полифенольные соединения избирательно влияют на потенциал митохондриальной мембраны, гликолиз и прооксидантно-антиоксидантные пути в раковых клетках. А также их противораковая активность может быть связана с протонофорным свойством, так как полифенолы рассеивают мембранный потенциал и таким образом приводят к разобщению митохондрий [16, p. 1589], и их прооксидантный эффект может быть связан с их проапоптотическим эффектом [13, p. 371].

Заключение. Таким образом, показано, что исследованные полифенольные соединения Глюкопир Т и Ксилопир Т приводят к ингибированию митохондриальной мегапоры печени крысы и полумаксимальная концентрация ингибирования составляет 42,2 ± 3,8 мкМ и 101,7 ± 3,1 мкМ соответственно.

Список литературы:

1. Антиоксидантные и мембраноактивные свойства 1,4,6-три-о-галлоил-2,3-валонеил-β-d-глюкозы / У.Г. Гайибов, Э.Дж. Комилов, Н.А. Эргашев, Р.Н. Рахимов [и др.] // J. Eur. Med. (Словакия). – 2018. – № 1 – С. 1–15.
2. Владимиров Ю.А. Нарушение барьерных свойств внутренней и наружной мембран митохондрий, некроз и апоптоз // Биол. мембраны. – 2002. – Т. 19. – № 5. – С. 356–377.
3. Действие гидролизуемого танина на нативные и искусственные биологические мембраны / М.П. Борисова, А.А. Катаев, С.М. Мавлянов, Н.Г. Абдулладжанова // Биол. мембраны. – 2014. – Т. 31. – № 4. – С. 278–287.
4. Кальцийзависимая неспецифическая проницаемость внутренней митохондриальной мембраны не индуцируется в митохондриях дрожжей Endomyces magnusii / Ю.И. Дерябина, Е.П. Исакова, Е.И. Шурубор, Р.А. Звягильская // Биохимия. – 2004. – Т. 69. – № 9. – С. 1261–1270.
5. Транспорт ионов Са²⁺ митохондриями: механизмы, молекулярные структуры и значение для клетки / К.Н. Белослудцев, М.В. Дубинин, Н.В. Белослудцева, Г.Д. Миронова // Биохимия. – 2019. – Т. 84. – № 6. – С. 759–775.
6. Cyclosporin A increases mitochondrial buffering of calcium: an additional mechanism in delaying mitochondrial permeability transition pore opening / J. Mishra, A.J. Davani, G.K. Natarajan, W.-M. Kwok [et al.] // Cells. – 2019. – V. 8. – № 9. – P. 1–23.
7. Free radicals, antioxidants and functional foods: Impact on human health / V. Lobo, A. Patil, A. Phatak, N. Chandra // Pharmacogn Rev. – 2010. – V. 4. – № 8. – P. 118–126.
8. Gornall A.G., Bardawill C.J., David M.M. Determination of serum proteins by means of the biuret reaction // J Biol Chem. – 1949. – V. 177. – № 2. – P. 751–766.
9. Halestrap A.P., Richardson A.P. The mitochondrial permeability transition: a current perspective on its identity and role in ischaemia/reperfusion injury // J Mol Cell Cardiol. – 2015. – V. 78. – P. 129–141.
10. Hauser D.N., Hastings T.G. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson's disease and monogenic parkinsonism // Neurobiol Dis. – 2013. – V. 51. – P. 35–42.
11. He L., Lemasters J.J. Regulated and unregulated mitochondrial permeability transition pores: a new paradigm of pore structure and function? // FEBS Lett. – 2002. – V. 512. – № 1–3. – P. 1–7.
12. Influence of new polyphenol compound from Euphorbia plant on mitochondrial function / U.G. Gayibov, E.J. Komilov, R.N. Rakhimov, N.A. Ergashev [et al.] // J. Microbiol. Biotech. Food Sci. – 2019. – V. 8. – № 4. – P. 1021–1025.
13. León-González A.J., Auger C., Schini-Kerth V.B. Pro-oxidant activity of polyphenols and its implication on cancer chemoprevention and chemotherapy // Biochem Pharmacol. – 2015. – V. 98. – № 3. – P. 371–380.
14. Schneider W.C., Hogeboom G.H. Cytochemical studies of mammalian tissues: the isolation of cell components by differential centrifugation // Cancer. Res. – 1951. – V. 11. – № 1. – P. 1–22.
15. Stabilization of erythrocytes against oxidative and hypotonic stress by tannins isolated from sumac leaves (Rhus typhina L.) and grape seeds (Vitis vinifera L.) / E. Olchowik, K. Lotkowski, S. Mavlyanov, N. Abdullajanova [et al.] // Cell Mol Biol Lett. – 2012. – V. 17. – № 3. – P. 333–348.
16. Stevens J.F., Revel J.S., Maier C.S. Mitochondria-centric review of polyphenol bioactivity in cancer models // Antioxid Redox Signal. – 2018. – V. 29. – № 16. – P. 1589–1611.
17. Tannin profile, antioxidant properties, and antimicrobial activity of extracts from two Mediterranean species of parasitic plant Cytinus / G. Maisetta, G. Batoni, P. Caboni, S. Esin [et al.] // BMC Complement Altern Med. – 2019. – V. 19. – № 1. – P. 1–11.