Сравнительный анализ антиоксидантной активности кверцетина и дигидрокверцетина при экспериментальном гипотиреозе

АННОТАЦИЯ

В данной статье рассмотрено влияние «Кверцетина» и «Дигидрокверцетина» на течение экспериментального гипотиреоза и представлены результаты сравнительного исследования антиоксидантной активности. В ходе проведенных исследований было определено, что влияние на уровень малонового диальдегида, как конечного продукта перекисного окисления липидов, среди индивидуальных веществ в наибольшей мере оказывает дигидрокверцетин. Исследования показали, что «Кверцетин» в дозе 10 мг/ кг оказывает выраженное влияние на тиреоидный статус при экспериментальном гипотиреозе, восстанавливая структуру щитовидной железы, а при введении мерказолила во всех случаях увеличивается содержание МДА в гомогенатах тканей подопытных крыс по сравнению с контролем (условно здоровые крысы), что свидетельствуют о том, что гипотериоз приводит к усилению свободнорадикального окисления и накопления в организме малонового диальдегида. Введение исследуемых нами полифенолов после мерказолилового стресса значительно ингибировало образование МДА.

ABSTRACT

In this article the effect of "Quercetin" and "Dihydroquercetin" on the course of experimental hypothyreosis and presents the results of a comparative study of antioxidant activity was studied. In the course of the studies, it was determined that the effect on the level of malondialdehyde, as the end product of lipid peroxidation, among individual substances, is most strongly exerted by dihydroquercetin. Studies have shown that "Quercetin" at a dose of 10 mg / kg has a pronounced effect on the thyroid status in experimental hypothyriosis, restoring the structure of the thyroid gland of rats, which indicates that hypothyriosis leads to increased free radical oxidation and accumulation of malondialdehyde in the body. The introduction of the studied polyphenols after mercazolyl stress significantly inhibited the formation of MDA.

Ключевые слова: флавоноиды, кверцетин, дигидрокверцетин, свободные радикалы, окислительный стресс, гипотериоз,  ПОЛ, МДА.

Keywords: flavonoids, quercetine, dihydroquercetine, free radicals, oxidative stress, hypothyreosis, POL, MDA.

Флавоноидые соединения, как пигменты растительного происзождения, известны уже давно. Однако, первая работа, которая была посвящена изучению биологической активности этих соединений, была опубликована в 1936 году Альбертом де Сент-Дьёрди. В своей работе автор сообщил, что флавоноид, который был выделен из венгерского красного перца, может способствовать укреплению ломких стенок кровеносных сосудов [1, C. 27]. Кроме этого, в работе было предположено, что данное выделенное соединение, возможно, относится к соединениям группы витаминов, и предложено для него название «витамин P» [2, с. 25]. Новая волна интереса к этим соединениям флавоноидам началась в 1990-х годах. Она связана с открытием их антиоксидантных свойств и способности нейтрализовать свободные радикалы.

На сегодняшний день терапия патологий щитовидной железы является актуальной проблемой в медицине и практического здравоохранения. Отмечается неуклонный рост данной патологии, которое в основном обусловлено экологической обстановкой, а также дефицитом йода в окружающей среде. Вовлечение в патологический процесс практически всех органов и систем в результате данной патологии обусловливают большое медицинское и социальное значение, которое требует своевременного лечения и профилактики гипотиреоза. [3, с. 57]. В этой связи представляет большой интерес разработки фармакологических препаратов на основе растительного сырья - антиоксидантов, которые предназначены для лечения и профилактики функции щитовидной железы в целом. Из литературы известно, что одним из лекарственных растений, применяемых для лечения и профилактики заболеваний щитовидной железы, является лапчатка белая (Potentilla Alba L.). В результате проведенных клинических исследований в данной работе установлено, что основные соединения, т.е. флавоноидные компоненты эффективны при коррекции гиперфункции и гипофункции щитовидной железы [4, с. 24].

Большой интерес среди ученых разного профиля к изучению биологической активности флавоноидов, вызван их многообразием фармакологических свойств, проявляющих в организме человека и животных. Биологическая активность флавоноидов проявляется, в основном, балансированием окислительно-восстановительных процессов, мембраноактивными свойствами, модуляцией ферментативной активности и их рецепторов [5, с. 7]. По литературным данным известно, что уже определено, что дигидрокверцетин, кверцетин, рутин и препараты на их основе, такие как силимар и карсил, обуславливаются комплексным действием на неферментативные и ферментативные процессы антиоксидантной защиты и могут быть рекомендованы для назначений при различных изменениях в антиоксидантной системе при поражениях печени токсической природы. Учитывая, что антиоксидантная активность флавоноидов зависит от их химического строения, представляется актуальным создание комбинированных лекарственных средств, в которых могут реализовываться различные механизмы действия и различной степени антиоксидантной активности [6, с. 25]. На сегодняшний день хорошо известен спектр действия этих соединений на организм человека: антиоксидантное, иммуномодулирующее, антигипоксическое, противовоспалительное, антигрибковое, капилляроукрепляющее, спазмолитическое, антистрессовое, антибактериальное, противовирусное, противоязвенное, антиаллергическое, антиканцерогенное, гепатопротекторное [7, с. 996]. Такие свойства флавоноидов открывают широкие возможности их использования в качестве лекарственных средств, не оказывающих серьезных побочных эффектов в отличие от синтетических аналогов.

В настоящее время доказана роль свободнорадикальных процессов (СРП) в развитии различных патологических процессов, протекающих в организме [8, с. 284]. Одним из способов предотвращения процесса окислительного стресса является использование соединений с антиоксидантной активностью, которые способны в малых концентрациях ингибировать чрезмерное образование свободных радикалов [9, с. 252].

В последнее время в качестве антиоксидантов большой интерес вызывают такие соединения как кверцетин (KB) и его производное дигидрокверцетин (ДГК) (таксифолин). Эти природные флавоноиды выделяют из древесины лиственницы. В литературе описывается, что более широким спектром биологической активности обладает ДГК. Он способствует уменьшению проницаемости и ломкости капилляров, снимает спазмы гладкой мускулатуры, обладает высокой антиоксидантной активностью [10, с. 34]. Однако, работ, посвященных защитному действию флавоноидов в условиях гипотериоза немного, что и определило цели настоящего исследования. Целью данной работы явилось усовершенствование модели экспериментального мерказолилового гипотиреоза, применяемого для экспертной оценки биологической активности йодообогащенных рационов. Основной задачей являлось определение той средней дозы мерказолила, которая в определенные сроки введения обеспечивает развитие признаков, характерных для йододефицитного заболевания таких как снижение уровня содержания свободного тироксина (сТ4), 3,5,3^, трийодтиронина (Т3) при увеличении концентрации тиреотропного гормона (ТТГ) в сыворотке крови белых крыс. Также, в цели исследования входило изучение восстановления антиоксидантных свойств в тканях различных органов (головного мозга, поджелудочной железы, тонкого кишечника, селезенки и печени) флаваноидами (кверцетин и дигидрокверцетин) при дефиците гормона щитовидной железы.

Материалы и методы

Гипотиреоз моделировали на половозрелых крысах – самцах массой 150-180 г, находившихся на стандартном питании вивария, путем перорального введения мерказолила. Животные были разделены на 5 групп по 12 в каждой: 1-я – контрольная, у крыс 2, 3, 4 и 5-й групп вызывали мерказолиловый гипотиреоз введением соответственно 10 мг препарата на 100 г массы тела в течение 14-и суток [11, c. 87]. Для стандартизации исследований убой животных производили в одно и тоже время суток (утром) под эфирным наркозом. У крыс после декапитации брали кусочки щитовидной железы и фиксировали в 10%-ном растворе формалина. Срезы толщиной 7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. В сыворотке крови подопытных крыс определяли уровень содержания гормонов щитовидной железы – свободного тироксина (сТ4), 3,5,3′ - трийодтиронина (Т3), а также тиреотропного гормона (ТТГ) методом иммуноферментного анализа с использованием стандартных наборов тест-систем ОАО «Алкор-Био» (Санкт-Петербург). Статистическую обработку данных проводили с использованием стандартных методов по программе «Statistica-5.0» Windows 95. Оценку значимости различий среднеарифметических проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Статистически значимыми считали различия при Р<0,05.

Определение антирадикальной активности исследуемых образцов проводили согласно [11, с. 848]. путем фиксирования изменения оптической плотности свободного радикала ДФПГ (дифинилпикрилгидразил). Для оценки АРА в данной работе использована методика спектрофотометрического измерения кинетики восстановления молекул стабильного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (ДФПГ) антиоксидантами. Исследуемые соединения растворяли в воде при концентрации 1 мг/мл.

Для определения антирадикальной активности соединений по отношению к перекиси водорода использована методика, основанная на методе Руча. Образцы добавляли отдельно в каждую пробирку, содержащую 2 мл 20 мМ фосфатного буфера, 1 мл 43 мМ раствора пероксида водорода и 1 мл дистиллированной воды. Поглощения раствора фосфатного буфера и раствора перекиси водорода без фосфатного буфера использовали в качестве контроля. После инкубации при комнатной температуре в течение 10 минут измеряли оптическую плотность образцов при 230 нм по отношению к контрольному раствору фосфатного буфера. Процент поглощения пероксида водорода рассчитывали по следующей формуле: H₂O₂% = [(Ac-Ae)/Ac x 100] где Ac = оптическая плотность раствора перокиси водорода без фосфатного буфера и Ae = оптическая плотность образцов [13, с. 1284].

Результаты и обсуждение

В последнее время повышен интерес к изучению роли свободных радикалов, таких как активные формы кислорода (АФК) и азота (АФА), в патогенезе различных заболеваний. С одной стороны, АФК и АФА образуется в ходе естественных физиологических процессов организма и необходимы для поддержания иммунной системы, передачи клеточных сигналов и синтеза гормонов. С другой стороны, окислительный стресс, вызванный высокими концентрациями свободных радикалов, может привести к повреждению ДНК, белков, мембранных липидов. Наиболее выражены последствия свободно-радикального повреждения клеток при таких патологиях как сахарный диабет, гепатит, сердечнососудистых, бронхолёгочных и онкологических, т.е. не инфекционных заболеваниях. Необходимый уровень АФК в организме поддерживается антиоксидантной системой. Однако, в ряде случаев, особенно в патологических, эта система не срабатывает, что приводит к осложнению патологического процесса.

Кроме этого, в патогенезе гипотериоза важная роль принадлежит активации процессов свободнорадикального окисления (СРО): дисбаланс между прооксидантами и антиоксидантами, приводящий к избытку свободных радикалов и высокотоксичных продуктов СРО. В серии экспериментальных работ показано, что развитие гипотериоза и его осложнений можно предупредить или замедлить с помощью антиоксидантной терапии [14, с. 1410]. В последние годы интенсивно изучалось использование антиоксидантов у больных с гипотериозом, что позволило получить сведения о механизме их действия и эффективности. 

Антиоксидантная терапия (витамины С и Е) у животных с индуцированным гипотериозом предупреждает появление и уменьшает выраженность ранних морфологических и гемодинамических изменений в почках и нарастание альбуминурии.

Таким образом, накопленные к настоящему времени данные позволят рассматривать изучение антиоксидантной активности препаратов как весьма перспективные препараты, способные оказывать протективное действие как на функцию щитовидной железы, так и на механизмы развития других осложнений гипотериоза.

Поскольку антиоксиданты могут обладать разными механизмами действия, изучение их активности целесообразно проводить с использованием различных методов. В данной работе АРА соединений оценивали двумя методами: 1) по отношению к свободному радикалу ДФПГ и 2) по отношению к перекиси водорода.

При добавлении исследуемых соединений в спиртовой раствор ДФПГ происходит переход свободно-радикальных молекул в нерадикальную форму, при этом интенсивно фиолетовый раствор ДФПГ обесцвечивается. На рис. 1 представлена кинетика изменения оптической плотности раствора ДФПГ при добавлении исследуемых нами образцов.

Для сравнения АРА исследуемых образцов выбрали концентрацию для каждого соединения 5, 10, 25, 50 и 100 мкл, соответственно из приготовленного раствора концентрацией 1 мМ вещества. Анализируя полученные результаты можно заключить, что при добавлении в спиртовый раствор ДФПГ исследуемых полифенолов наблюдается резкое снижение оптической плотности раствора ДФПГ, что свидетельствует о антирадикальной способности исследуемых соединений кверцетина и дигидрокверцетина.

На рисунке 1 представлены результаты кинетики оптической плотности спиртового раствора ДФПГ при добавлении кверцетина и дигидрокверцетина в объёме 50 мкл (соотношение ДФПГ: полифенол соответствует 2:1).

Рисунок 1. Изменение оптической плотности спиртового раствора ДФПГ по отношению к контролю при добавлении исследуемых соединений в зависимости от времени.

Сплошная линия построена на основании нелинейной регрессии. Концентрация ДФПГ 0.1 мМ. Измерения проводились при 20^оС сразу после добавления исследуемых препаратов. Концентрация исследуемых соединений 50 мкл из приготовленного ранее раствора 1 мМ.

Из экспериментальных данных следует, что исследуемые соединения обладает высокой способностью к тушению свободного радикала ДФПГ. Для количественной оценки антирадикальной активности использовали стабильный радикал 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (ДФПГ), а также параметр t₅₀ – время, необходимое изучаемым препаратам для снижения исходной концентрации радикала на 50%. В реакции ДФПГ t₅₀ при 17 ^оС составляет для кверцетина – 9,6 сек. и для дигидрокверцетина 105 сек. (таблица 1).

Таблица 1.

Значения константы скорости реакции, концентрация, ингибирующая на 50 % (IC₅₀) и время необходимое для снижения концентрации ДФПГ на 50 % (t₅₀) при реакции с исследуемыми полифенолами

Далее была изучена антирадикальная активность кверцетина и дигидрокверцетина по отношению к перекиси водорода. Полученные результаты показали наличие ингибирующего эффекта по отношению к этой форме АФК. Антирадикальная активность кверцетина и дигидрокверцетина по отношению к перекиси водорода составила 76±4,3 и 64±2,6, соответственно, при добавлении исследуемых образцов в инкубационную среду в объёме 150 мкл из ранее приготовленного раствора 1 мМ. Такой характер поведения является, по всей видимости, следствием наличия нескольких гидроксильных групп с подвижным водородом в молекулах исследуемых соединений. Причем АОА кверцетина, согласно литературным данным, значительно превышает активность рутина [15, с. 102].

Анализ экспериментальных результатов, полученных при исследовании кверцетина и дигидрокверцетина, показал, что соединение кверцетин обладает более высокой АРА по сравнению с дигидрокверцетином по отношению к свободным радикалам (ДФПГ и Н₂О₂), для которого константа реакции с ДФПГ наибольшая, величина которой может служить антирадикальной эффективности соединения.

Повреждающему эффекту свободных радикалов и активных форм кислорода противостоит система противоокислительной защиты, главным действующим звеном которой являются антиоксиданты — соединения, способные тормозить, уменьшать интенсивность свободнорадикального окисления (СРО), нейтрализовывать СР путем обмена своего атома водорода (в большинстве случаев) на акцепторного атома свободных радикалов (кислород, азот). Антиоксиданты могут быть природного (биоантиоксиданты) и синтетического происхождения. Вещества этой группы имеют подвижный атом водорода и поэтому реагируют со свободными радикалами, а также катализаторами свободнорадикального окисления. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в молекулах исследованных соединений имеются подвижные атомы водорода, проявляющие высокую антирадикальную активность.  

В связи с этим, учитывая, что кверцетин и дигидрокверцетин обладают высокой антирадикальной активностью, представляется важным изучение возможности коррекции нарушений, возникающих у больных с гипотериозом и рассматривать как перспективного антиоксидантного и  противогипотериозного препарата. Исходя из этого, далее в наших исследованиях изучена влияние двух полифенольных соединений на окислительный стресс различных органов крыс в условиях модельного гипотериоза.

ПОЛ является нормальным физиологическим процессом, постоянно протекающим в мембранах клеток и играющим важную роль в процессах метаболизма. При накоплении продукты ПОЛ оказывают токсичное влияние на клеточные структуры, что способствует развитию патологических процессов. Изменения в тиреоидном статусе приводят к изменению количества как водорастворимых, так и жирорастворимых антиоксидантов, а также к нарушению ПОЛ. Учитывая имеющиеся данные литературы, можно предположить, что при снижении уровня тиреоидных гормонов интенсивность ПОЛ снижается, а антиоксидантная активность нарушается. Вероятно, эта активность нарушается вследствие выхода в кровеносное русло продуктов измененного метаболизма перекисного окисления липидов. В настоящее время не до конца выяснена связь между уровнем тиреоидных гормонов и естественной антиоксидантной защитой, в связи с чем сохраняется актуальность выявления информативных и доступных критериев оценки адекватности терапии при аутоиммунном тиреоидите и гипотиреозе с учетом уровня перекисного окисления липидов и состояния естественной антиоксидантной защиты организма.

Исходя из этого, дальнейшая серия исследований была посвящена измерению содержания продуктов перекисного окисления липидов – МДА – в гомогенате ткани органов (щитовидная железа, поджелудочная железа, печень, почки, сердце, мозг и репродуктивная функция) из различных групп подопытных животных. В экспериментах использовались следующие группы животных:

1. Интактные крысы (контроль) (n = 8).

2. Крысы, получавшие мерказолил в течение двух недель, в дозе 0,5 мг на 100 г массы тела (n = 8).

3. Крысы, получавшие меркозолил и кверцетин в течение двух недель, в дозе 0,5 мг на 100 г массы тела (n = 8).

4. Крысы, получавшие мерказолил и дигидрокверцетин в течение двух недель, в дозе 0,5 мг на 100 г массы тела (n = 8).

5. Крысы, получавшие мерказолил в течение двух недель, в дозе 0,5 мг на 100 г массы тела (n = 8), после 14 дней кверцетин (для профилактики).

6. Крысы, получавшие мерказолил в течение двух недель, в дозе 0,5 мг на 100 г массы тела (n = 8), после 14 дней дигидрокверцетин (для профилактики).

Исследование процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) показало, что при введении мерказолила во всех случаях увеличивается содержание МДА в гомогенатах тканей подопытных крыс по сравнению с контролем (условно здоровые крысы), что свидетельствуют о том, что гипотериоз приводит к усилению свободнорадикального окисления и накопления в организме малоновго диальдегида.  Введение исследуемых нами полифенолов после мерказолилового стресса значительно ингибировало образование МДА (рис. - 3).

Рисунок 2. Изменение количества МДА в различных органах интактных крыс и крыс с гипотериозом

Из рисунка 2 видно, что наибольшее содержание МДА в органах наблюдается в почках и в мозге.

Следует отметить, что окислительный стресс также наблюдался в щитовидной железе. При введении полифенольных соединений кверцетина и дигидрокверцетина наблюдается снижение количества МДА в гомогенате щитовидной железы.  

Выводы

1. Исследованные соединения проявляют высокую антирадикальную активность по отношению к свободным радикалам ДФПГ и Н₂О₂ в модельных системах in vitro. При этом более выраженная активность наблюдалась у кверцетина по сравнению с дигидрокверцетином, реализуемая как перехват свободных радикалов и активных форм кислорода.

2. Установлено, что кверцетин и дигидрокверцетин в гомогенате тканей различных органов дозазависимо проявляли свойство ингибирования ПОЛ, проявляя, таким образом, антиоксидантную активность.

3. Полученные в данной работе результаты позволяют изучить возможность создания на основе данных соединений лекарственных препаратов с антигипотериозической активностью, механизм действия которых, возможно, связан с антиоксидантной активностью.

Список литературы:

1. Rusznyak S. P., Szent-Gyorgyi A. Vitamin P: flavonols as vitamins // Nature. — 1936. — Т. 138. — С. 27
2. Ross J. A, Kasum C. M. Dietary flavonoids: bioavailability, metabolic effects, and safety // Annu Rev Nutr. — 2002. — Т. 22. — С. 19—34.
3.  Э.В. Архипова, Г.Х. Дамдинова Влияние «Тиреотона» на морфофункциональное состояние щитовидной железы при экспериментальном гипотиреозе // Бюллетень ВСНЦ. – 2012, № 6. – С. 55–59.)
4. Башилов А.В. Potentilla alba L. – эффективное средство при тиреотоксикозе // Вестник ВГМУ. – 2009. – Т. 8, № 3. – С. 1–9. Каюкова В.А. Эксперимент с лапчаткой оправдал надежды // Народный доктор. – 2004. –№ 16. – С. 21–28.].
5.  Смірнов О., Косик О. Флавоноїди рутин і кверцетин. Біосинтез, будова, функції // Вісн.Львів. ун-ту. Сер. Біологія. — 2011. — 56. — С. 3—11.
6. Куркин В.А., Авдеева Е.В., Правдивцева О.Е., Куркина А.В., Рыжов В.М., Росихин Д.В., Агапов А.И., Кулагин О.Л. Сравнительное исследование антиоксидантной активности некоторых флавоноидов и гепатопротекторных лекарственных препаратов на основе плодов расторопши пятнистой // Современные проблемы науки и образования. – 2016. – № 6.
7. Parr A.J., Bolwell G.P. Phenols in the plant and man. The potential for possible nutritional enhancement of the diet by modifying the phenols content or profile // J. Sci. Food Agr. —2000. — 80. — P. 985—1012.
8. Меныцикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин В.З., Бондарь И.А., Труфакин В. А. Окислительный стресс: патологические состояния и заболевания,- Новосибирск: APTA, 2008. 284с.
9. Ю.А. Владимиров. М.: Знание, 1979. -48 с., Владимиров, Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю. А. Владимиров, А. И. Арчаков. М.: Наука, 1972. - 252 с,
10.  Тюкавкина Н.А., Берлянд А.С., Елизарова Т.Е. Стандартизация и    контроль качества лекарственных средств. 1995. С. 33–37).
11. Козлов В.Н. Тиреоидная трансформация при моделировании эндемического эффекта у белых крыс в эксперименте // Сибирский медицинский журнал. – 2016. – № 5.;
12. Ceriello A. // Diabet. Med. -1997 – V. 14 – Suppl. 3 – P. 845-849
13. Gayibova, S. et al. (2019). In vitro screening of antioxidant and antimicrobial activities of medicinal plants growing in Slovakia. Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences, 8(6), 1281-1289. https://doi:10.15414/jmbfs.2019.8.6.1281-128
14. Craven P.A., DeRubertis F.R., Kagan V.E. et al. // J.Am.Soc. Nephrol – 1997 – V.8 № 9 – P. 1405-1414.
15. Pieper G.M. Siebeneich W.J. // Cardiovascular Pharmacology – 1998 – V.32 № 1 – P. 101-105.