Получение и состав комплексов сульфата меди (II) с коллагеном

АННОТАЦИЯ

Получены комплексные соединения сульфата меди (II) с коллагеном при разных соотношениях раствора медного купороса и раствора коллагена. С увеличением содержания соли в исходной смеси возрастает выход продукта реакции. Реакция комплексообразования, состав, строение и структура комплекса исследованы методами ИК спектроскопии и сканирующей электронной микроскопии. Установлено образование комплексного соединения за счет координационного взаимодействия  с атомом азота и кислорода коллагена и кислорода воды. В широком диапазоне исходных соотношений веществ состав комплексного соединения изменяется не значительно. При избытке соли почти вес коллаген связывается в комплекс и образуется монокристалл ромбической формы.

ABSTRACT

Complex compounds of copper (II) sulfate with collagen were obtained at different ratios of copper sulfate solution and collagen solution. With an increase in the salt content in the initial mixture, the yield of the reaction product increases. The complexation reaction, composition, structure and structure of the complex were investigated by IR spectroscopy and scanning electron microscopy. The formation of a complex compound was established due to the coordination interaction of with the nitrogen and oxygen atom of collagen and oxygen of water. In a wide range of initial ratios of substances, the composition of the complex compound does not change significantly. With an excess of salt, almost the weight of the collagen binds into a complex and a rhombic single crystal is formed.

Ключевые слова: мед, коллаген, комплекс, состав, краситель.

Keywords: copper, collagen, complex, composition, dye.

Введение

В последние десятилетия коллагеновым биоматериалам уделяется особое внимание благодаря своим превосходным свойствам, таким как низкая иммуногенность, биоразлагаемость, биосовместимость, гидрофильность, простота обработки и т. д. [1]. Однако коллаген также имеет некоторые не удовлетворительные физические и химические свойства (механическая прочность, термостабильность, устойчивость к ферменту и т. д.). Следовательно, необходима модификация коллагена в процессе получения различных материалов. Металлосодержащие полимерные комплексы повсеместно распространены в биологических системах, а их уникальные структуры обеспечивают разнообразные биологические свойства [2]. Сочетание нескольких компонентов или иерархий из естественного источника с помощью простого метода может выступать в качестве предшественника при разработке и применении материалов. Получена биосистема металлоорганических соединений на основе коллагеновой волокнистой матрицы с комплексом хрома (III) [3]. Полученный комплекс сохраняет внутреннюю конформацию коллагена и морфологию его волокон в коже, показал улучшенную водонепроницаемость и воздухопроницаемость. Выявление взаимосвязи между структурой и объединенными свойствами комплекса способствует прогрессу интеллектуальных белковых материалов.

Ионы металлов влияют на термостабильность белков, увеличивая или уменьшая их устойчивость к разворачиванию [4]. Взаимодействие между ионами металлов и пептидами вызвало интерес из-за важной роли ионов металлов во многих биологических процессах и потенциального применения в различных областях. Конформационные изменения пептидов зависят от характера связывания c ионами металлов [5]. Медь участвует в нескольких биологических процессах, образуя комплексы с белковыми веществами [6]. Координационный комплекс медно-биоактивных каркасов использовали в качестве носителя двух противораковых агентов [7]. Коллагеновые мембраны в сочетании с комплексами золота и нуклеиновых кислот служат материалами для восстановления роговицы, могут быстро восстанавливать роговицу и эффективно ингибировать образование рубцов [8]. Образование комплексов белков с ионами металлов способствует их кристаллизации, причем успехи в макромолекулярной кристаллизации быстро умножались в последние годы благодаря появлению практичных, простых в использовании комплектов для скрининга и применению лабораторной робототехники [9].

Таким образом, очень большое значение в различных сферах, особенно в медицине, приобретают комплексные соединения гетероатомсодержащих полимеров, в том числе белков. Коллагеновые материалы находят применение и в текстильной промышленности. Известно формование волокон из коллагена [10], использование его в тканевой инженерии [11] как каркас для наночастиц [12]. Пористые углеродные волокна с диаметром в диапазоне от 30 до 50 мкм были получены путем мокрого формования коллагеновых материалов [13]. Раствор коллагена используется также для шлихтования [14] и огнезащитной обработки хлопковой пряжи перед ткачеством [15], в составе композиции для придания формоустойчивости [16] и огнестойкости [17] материалу. Не достаточное внимание уделяется возможности использования металлокомплексов коллагена в качестве красителей для текстильных материалов. Стабильные во времени комплексы коллагена с ионами металлов являются своеобразными цветными веществами.

Целью данной работы является синтез, определение состава и микроструктуры комплексов сульфата меди (II) c коллагеном для применения в качестве красителя текстильного материала.

Экспериментальная часть

Получение раствора коллагена. Очищенные от шерсти отходы сырой кожи крупного рогатого скота разрезали на куски размерами 3-4 мм и помещали в емкость. В емкость наливали 2%-ный раствор гидроксида натрия. На 100 массовых частей раствора внесли 60-80 массовых частей кусочков шкуры, которые набухают в растворе щелочи в течение 12-24 часов. Затем раствор перемешивали до образования однородной массы, подогревая при необходимости, до температуры 50^ºС. Образованную смесь пропустили через сито размерами ячеек 0,05-0,1 мм. В полученный раствор добавляли уксусную кислоту с целью нейтрализации до рН=7±0,2. После нейтрализации раствор становится прозрачным, т.е. образуется вязкий (коллоидный) раствор полимера.

С целью удаления ионов и низкомолекулярных веществ из раствора произвели диализ раствора коллагена с помощью диализного мешочка, изготовленного из лошадиной кишки. Время и полноту диализа контролировали по удельной электропроводности раствора. В исследованиях использовали раствор коллагена после 24 часов диализа, электропроводность этого раствора 46·10^-4 ом^-1·см^-1, pH=6,8, массовая доля коллагена 6%.   

Синтез комплексов . Для синтеза комплексов 14,4%-ный раствор CuSO₄ (плотность 1,16 г/мл) и 6%-ный раствор коллагена (плотность 1,02 г/мл) смешивали при разных массовых соотношениях. В течение суток не прореагировавшая часть выпадает в осадок, которую отделили фильтрованием. При испарении фильтрата образуются кристаллы комплекса  с коллагеном. Комплексные соли высушили при температуре 60^оС до постоянной массы.   

Показатель pH растворов определили с помощью автоматического титратора «EasyPlus^TM Titration».

Массовую долю веществ в растворе определили по массе сухого остатка.

Плотность растворов определили пикнометрическим методом.

ИК-спектры комплексов снимали на ИК-Фурье спектрофотометре марки Nicolet iS50 (Thermo Scientific, USA) с приставкой внутреннего отражения и микроскопом Continuum.

Исследование микроструктуры комплексов проведено на сканирующем электронном микроскопе (EVO/LS10) на проходящих лучах (SEM-EDX) в комплекте с Системой микроанализа и Напылительной установкой. Для каждого образца сканированы не менее трех участков и вычислены средние значения массовой доли обнаруженных элементов.

Результаты и обсуждение

Для проведения химических реакций, в том числе для синтеза комплекса ионов металла с белковыми макромолекулами, следует освободить раствор коллагена от электролитов. С этой целью мы проводили диализ раствора коллагена, сменяя воду в диализаторе каждые два часа. Синтез комплексных соединений при разных соотношениях соли меди и коллагена позволил предварительно оценит их состав. При определении количества аминокислотных звеньев коллагена в молях, средняя молекулярная масса одного звена рассчитана как сумма произведений молекулярной массы одного звена на его массовую долю. В таблице 1 приведена зависимость выхода комплексного соединения от соотношения компонентов.

Таблица 1.

Исходные соотношения компонентов и выход комплексного соединения

Как видно из данных таблицы 1, с увеличением массовой доли  возрастает выход комплекса. Причем, при массовом соотношении растворов  : коллаген = 8:2 и 6:4, масса комплекса больше, чем сумма масс соли и коллагена. Это свидетельствует о том, что некоторая часть воды связывается в комплекс посредством координационной связи.

Для установления механизма реакции комплексообразования проведены ИК спектроскопические исследования с Фурье преобразованием. Были анализированы Фурье-ИК-спектры  (рис. 1), коллагена (рис. 2) и комплексов, полученных при разных исходных соотношениях компонентов (рис. 3, 4).

Рисунок 1. Фурье-ИК-спектр

Рисунок 2. Фурье-ИК спектр коллагена

В ИК-спектрах  наблюдаются полоса поглощения при 1063 см^-1, отнесенная к иону . Слабые полосы поглощений при 1669, 865, 605-429 см^-1, видимо, относятся к колебаниям связей , . Полоса поглощения при 3112 см^-1 относится к валентным колебаниям связей ассоциированных молекул воды.

В Фурье-ИК-спектре коллагена обнаружены полосы поглощений валентных колебаний ассоциированных NH и OH групп в области 3274 см^-1, валентных колебаний  пептидной группы при 3068 см^-1, валентных колебаний  при 1633 см^-1 (полоса амид I), деформационных колебаний NH при 1528 см^-1 (полоса амид II) и при 1394 см^-1 (полоса амид III). Полосы поглощений при 1233-1202 см^-1 относятся к . Полосы поглощений при 1163-921 см^-1 относятся к колебаниям C–O связей. Валентные колебания C–H связей проявляют полосу поглощения при 2937 см^-1, деформационные колебания этих связей при 1448 см^-1.

В ИК-спектрах комплексных соединений  с коллагеном сохраняются полосы поглощений исходных веществ, но изменяется волновое число максимумов оптической плотности, и появляются новые сигналы. В спектрах комплексных соединений существенные изменения наблюдаются в области частот 1600-1000 см^-1, которые связаны с валентными и деформационными колебаниями связей пептидной, гидроксильной группы коллагена, сульфат иона соли. В спектрах всех комплексов имеется полоса колебаний сульфат иона, максимум которой незначительно смещается в высокочастотную область (1066 см^-1).

Полоса поглощения валентных колебаний ассоциированных NH и OH групп коллагена в области 3274 см^-1, в комплексах смещается в низкочастотную область. Причем степень смещения возрастает с увеличением молярной доли  в исходной смеси (таблица 2). Наблюдаемые изменения в Фурье-ИК спектрах комплексных соединений свидетельствуют об участии в координационном взаимодействии ионов меди, атомов кислорода и азота коллагена, кислорода воды.

Рисунок 3. Фурье-ИК спектр комплекса, синтезированный при исходном массовом соотношении растворов  : коллаген = 4 : 6

Рисунок 4. Фурье-ИК спектр комплекса, синтезированный при исходном массовом соотношении растворов : коллаген = 6 : 4

Таблица 2.

 Зависимость степени смещения полосы поглощения валентных колебаний NH и OH групп в комплексах от исходного соотношения компонентов

Следует отметить, что полоса поглощения NH и OH групп всех комплексов наблюдается в виде широкого моно сигнала. Это свидетельствует об упорядоченной ассоциации этих групп с ионами меди. Увеличение степени смещения этих полос от полосы коллагена к полосе  показывает о возрастании числа координированных ионов меди с увеличением количества соли.

Таблица 3.

Элементный состав комплексов -коллаген

Результаты элементного анализа по данным сканирующей электронной микроскопии позволили дополнить сведения о составе комплексного соединения. В таблице 3 приведены средние массовые доли элементов в составе комплексных соединений, синтезированных при разных исходных количествах компонентов.

Исходя из аминокислотного состава коллагена, в его макромолекуле на 1 атом азота приходится примерно 2,85 атомов углерода и 1,09 атомов кислорода. В комплексах : коллаген с увеличением количества соли увеличивается количество координированных ионов меди в комплексе. Факт того, что в составе комплекса содержится сера, свидетельствует о том, что сульфат-ионы связаны с комплексным ионом посредством ионных связей. При этом число атомов серы и кислорода не соответствует их числу в сульфате меди (II): серы – меньше, а кислорода – больше. Причем, кислорода больше, даже с вычетом кислорода самого коллагена. Это еще раз говорит о том, что в координации с ионами меди участвуют молекулы воды, особенно при избыточном содержании сульфата меди (II) в исходной смеси.

В комплексах на один ион меди (II) приходится 0.4-0.6 атомов серы и 5.0-6.7 атомов кислорода (в сульфате меди (II) на один ион меди приходится один атом серы и четыре атома кислорода). Тогда только половина от начального количества сульфат ионов оказывается в сфере анионов комплекса. Остальное количество анионов, видимо, составляют гидроксо- или карбоксо-ионы, которые образуются в результате частичного гидролиза коллагена при его выделении из шкуры. С учетом кислорода коллагена и сульфат иона на каждый ион меди остается 2-3 атома кислорода, значить 2-3 молекулы воды. Если предположить по аналогии с медным купоросом, одна молекула воды находится во внешней сфере комплекса, то 1-2 молекулы воды связаны с медью в качестве лигандов. Координационное число меди в комплексе равна четырем, о чем свидетельствует геометрическая форма кристаллов комплекса. В качестве остальных 2-3 лигандов комплекса выступают атомы азота и кислорода коллагена.

С изменением соотношения количества компонентов в начальной смеси наблюдается незначительное изменение количества атомов углерода. При этом сохраняется общая тенденция: с увеличением количества сульфата меди (II) массовая доля углерода в комплексе существенно уменьшается (от 40 до 15%), но число атомов соответствующего одному атому азота незначительно увеличивается (от 3.1 до 3.9 атомов). Число и характер координационных связей комплексообразователя, т.е. иона меди, не изменяется с изменением исходного соотношения веществ. Однако, с увеличением количества сульфата меди (II) увеличивается массовая доля ионов меди в комплексе за счет увеличения количества аминокислотных остатков коллагена, участвующих в комплексообразовании. В целом, состав и микроструктура комплекса «полимер-металл» изменяется, что приводит к изменению геометрической формы кристаллов. Комплекс, синтезированный при избытке сульфата меди (II), имеет строго ромбическую форму. Комплекс, синтезированный при избытке коллагена, имеет игольчатую форму. Причем, медленное испарение отфильтрованного раствора комплекса при комнатной температуре, позволяет получить четкий монокристалл ромбической формы. Несмотря на то, что акцептором комплекса является вещество полимерной природы, удалось сформировать чистый кристалл с координационным числом меди 4.

На основании проведенных исследований, один из вариантов строения комплекса можно представит следующей формулой:

Возможны другие варианты структурной формулы комплекса. В зависимости от исходного соотношения компонентов изменяется число ионов меди, молекул воды во внутренней и внешней сферах комплекса. Допускается координация иона меди с атомами двух макромолекул коллагена.

Синтезированные металлокомплексы коллагена были апробированы в качестве красителей текстильного материала. Равномерность окрашивания оценивали по изображениям внешнего вида крашеных образцов, устойчивость окраски – по изменению интенсивности цвета и потери массы образца после промывки в мыльно-содовом растворе. В результате крашения смесевой ткани хлопок-полиэфир, наилучшая равномерность окраски была достигнута при рН = 9, а прочность окраски при рН = 7.

Выводы

При смешивании растворов сульфата меди (II) и коллагена образуется комплексное соединение  : коллаген. В широком диапазоне соотношений исходных веществ состав синтезированного комплекса изменяется не адекватно, диапазон изменения состава комплексного соединения не широкий. Выход комплексного соединения уменьшается с увеличением количества коллагена в исходной смеси. При большом избытке коллагена некоторое его количество не участвует в комплексообразовании и выпадает в осадок. Предложена формула комплексного соединения, по которому акцепторами электронов являются атомы кислорода и азота коллагена, а также атомы кислорода воды. Синтезированный комплекс : коллаген может быть использован в качестве устойчивого красителя хлопковых и хлопка-полиэфирных тканей. 

Список литературы:

1. Xinhua Liu, Chi Zheng, Xiaomin Luo, Xuechuan Wang, Huie Jiang. Recent advances of collagen-based biomaterials: Multi-hierarchical structure, modification and biomedical applications // Materials Science and Engineering: C, 2019, Volume 99. P. 1509-1522.
2. Xu Q., Xu M., Lin C.-Y., Tian, Y., Xia Z. Metal Coordination-Mediated Functional Grading and Self-Healing in Mussel Byssus Cuticle // Advanced Science, 2019,            Volume 6(23). Article 1902043.
3. Yanting Han, Yuanzhang Jiang, Jinlian Hu, Xiaoyu Chen. Achieving coalesced breathability, mechanical and shape memory properties of collagen fibrous matrix through complexing with chromium (III) // Materials & Design, 2020 January, Volume 18615. Article 108206.
4. А. E. Sorenson, P. M. Schaeffer. A new bivalent fluorescent fusion protein for differential Cu(II) and Zn(II) ion detection in aqueous solution // Analytica Chimica Acta, 2020 March, Volume 11018. P.120-128.
5. Ziye Liu, Siyun Chen, Fangfang Qiao, Xinhao Zhang. Interaction of peptide backbones and transition metal ions: 1. an IM-MS and DFT study of the binding pattern, structure and fragmentation of Pd(II)/Ni(II)-Polyalanine complexes // International Journal of Mass Spectrometry, 2019, Volume 438. P. 87-96.
6. Tabbì G., Magrì A., Rizzarelli E. The copper(II) binding centres of carbonic anhydrase are differently affected by reductants that ensure the redox intracellular environment //Journal of Inorganic Biochemistry, 2019, Volume 199. Номер статьи 110759.
7. Sharma S., Mittal D., Verma A.K., Roy I. Copper-Gallic Acid Nanoscale Metal-Organic Framework for Combined Drug Delivery and Photodynamic Therapy // ACS Applied Bio Materials, 2019, Volume 2, Issue 5. P. 2092-2101.
8. Zhao X., Song W., Chen Y., Liu S., Ren L. Collagen-based materials combined with microRNA for repairing cornea wounds and inhibiting scar formation // Biomaterials Science, 2019, Volume 7, Issue 1. P. 51-62.
9. McPherson A. Protein crystallization // Methods in Molecular Biology, 2017, Volume 1607. P. 17-50.
10. Jose Моnсу V., Thomas Vinoy, Dean Derrick R., Nyairo Elijah. Fabrication and I Characterization of aligned nanofibrous PLGA/Collagen blends as оf pone tissue scaffolds // Polymer. 2009. №15. P. 3778-3785.
11. Song J.,  Zhang P., Cheng L., Liao Y., Xu B., Bao R., Wang W., Liu W. Nano-silver in situ hybridized collagen scaffolds for regeneration of infected full-thickness burn skin // J. of materials chemistry. 2015. V.B3 (20). P. 4231-4241.
12. Vedhanayagam M., Nidhin M., Duraipandy N., Naresh N.D., Jaganathan G., Ranganathan M., Kiran M.S., Narayan S., Nair B.U., Sreeram K.J. Role of nanoparticle size in self-assemble processes of collagen for tissue engineering application // Inter. J. of Biological Macromol. 2017. V.99. P. 655-664.
13. Salim N.V., Jin X., Mateti S., Lin H., Glattauer V., Fox B., Ramshaw J.A.M. Porous carbon fibers made from collagen derived from an animal by-product // Materials Today Advances. 2019. V.1. P. 31-38.
14. Rafikov A.S., Khakimova M.Sh., Fayzullayeva D.A., Reyimov A.F. Microstructure, morphology and strength of cotton yarns sized by collagen solution // Cellulose. 2020. V.27 (17). P. 10369-10384. DOI 10.1007 / s10570-020-03450-w.
15. http://link.springer.com/article/10.1007/s10570-020-03450-w
16. Karimov S.Kh., Rafikov A.S., Ibragimov A.T., Askarov M.A. (2015) A Reinforced Film of Graft Copolymers of Collagen and Acrylates // Inter. Polymer Sci. and Technology. V. 42(4). Р. 47-49.
17. Rafikov A.S., Yuldosheva O.M., Karimov S.Kh., Khakimova M.Sh., Abdusamatova D.O., Doschanov M.R. Three in one: sizing, grafting and fire retardant treatment for producing fire-resistant textile material // J. of Industrial Textiles. September, 2020.  https://doi.org/10.1177/1528083720957410
18. Nabiev N, Md. Raju A, Rafikov A, Quan H. Extraction of collagen from cattle skin and synthesis of collagen based flame retardant composition and introduction into cellulosic textile material by graft colypolimerization // Asian J. of Chem. 2017. V.29 (11). P. 2470-2475.