Оценка прогностической значимости P-ликопротеина в процессе лечения миом матки

АННОТАЦИЯ

Несмотря на безусловные достижения современной гинекологии, проблема повышения эффективности лечения больных с миомами матки по-прежнему остается актуальной. Необходимо отметить развитие побочных эффектов, устойчивость миоматозных клеток к препаратам и большое число противопоказаний к гормональной терапии. В данной статье проведен анализ экспрессии гена MDR1 при лечении различных миом матки. Показано, что повышение экспрессии гена MDR1 в процессе терапии является неблагоприятным прогностическим признаком агрессивности течения заболевания, обусловливает отсутствие ответа на терапию.

ABSTRACT

In spite of absolute achievements of modern gynecology, the problem of increase of efficiency of treatment of patients with hysteromyomas, still, remains actual. It is necessary to mark expressed of side effects, stability of miomatoz ages to medicinal preparation and large number of contra-indications to the hormonotherapy. In this article the analysis of expression of MDR1gene is at treatment of various hysteromyomas is carried out. It is shown that increase in an expression of a gene of MDR1 in the course of therapy is an adverse predictive sign of aggression of a course of a disease, causes lack of the answer to therapy.

Несмотря на безусловные достижения современной гинекологии, проблема повышения эффективности лечения гинекологических больных по-прежнему остается крайне актуальной. Если оставить в стороне вопросы ранней диагностики, которая в значительно степени определяет результат лечения, одним из препятствий в достижении желаемого эффекта является развитие лекарственной устойчивости, что является причиной неэффективного лечения. В полной мере это относится и к лечению различных форм миом матки, которые занимают одну из ведущих позиций в структуре болезней репродуктивных органов женщин [2, с. 19]. Существующая в настоящее время гормональная терапия миомы матки имеет ряд существенных недостатков. После прекращения гормонального лечения у большинства пациенток происходит рецидив клинической симптоматики. Необходимо отметить выраженность побочных эффектов, устойчивость миоматозных клеток к препаратам и большое число противопоказаний к гормональной терапии. Поэтому актуальной задачей гинекологии является органосохраняющее лечение больных миомой матки.

Причиной развития резистентности является активация выброса лекарственных препаратов из опухолевых клеток, что приводит к снижению их внутриклеточного содержания и как результат – к неэффективности проводимой терапии. Процесс осуществляется транспортными белками, так называемыми ABC-транспортерами, которые функционируют за счет энергии АТФ (ATP-binding cassette transporters). К одним из основных транспортных белков относится Р-гликопротеин (P-gp), который является продуктом экспрессии гена MDR1. Экспрессия Р-гликопротеина или кодирующего его гена в ряде случаев коррелирует с эффективностью лечения и прогнозом заболевания [5, c. 1650].

Одной из важнейших задач, стоящих перед практикующими врачами, является повышение эффективности и безопасности проводимой ими лекарственной терапии путем индивидуализации лечения больного. Для этого необходимо иметь полноценные представления об особенностях как лекарственного препарата (фармакокинетики и фармакодинамики), так и больного (индивидуальные характеристики пациента, в т. ч. генетические).

Цель исследования: изучение функциональной активности Р-гликопротеина и оценка его прогностической значимости при лечении миом матки.

Методы исследования

В качестве материала использовали кровь женщин с различными миомами матки. Кровь в объеме 1 мл брали с помощью катетера из локтевой вены в вакуумные пробирки с 0,5 М ЭДТА. Было исследовано 40 образцов крови женщин разного возраста и с различными формами миом матки.

Выделение ядерной ДНК из лейкоцитов крови

Все процедуры проводили в стерильных условиях. К 0,5 мл периферической крови добавляли 2 мл стерильной Н₂О, пробы инкубировали при комнатной температуре 2 часа. Клетки лейкоцитов осаждали при 3 000 об./мин., 4 °C, в течение 15 минут. Надосадочную жидкость аккуратно удаляли, к осадку желто-красных лейкоцитов добавляли 100 мкл стерильной дистиллированной воды и хранили при –20 °С. К суспензии лейкоцитов (1х10⁶) добавляли 1 мл лизирующего буфера (100 мМ Tris-HCl, рН 7,6; 25 мМ ЭДТА рН 8,0; 0,15 М NaCl; 1 % SDS, 2 мМ β-меркаптоэтанол), лизис проводили надо льдом 3 минуты. Затем пробы центрифугировали при 3 000 об./мин., 4 °C, 15 минут. Супернатант переносили в новые пробирки, добавляли равный объем смеси фенол-хлороформ (1:1), инкубация 15–20 минут при покачивании. Пробы центрифугировали 10 минут при 5 000 об./мин., 4 °С. К супернатанту добавляли хлороформ (1:2), инкубация при покачивании в течение 15–20 минут при 160 об./мин., пробы центрифугированием при 5 000 об./мин., 4 °C, 10 минут. Супернатант осаждали в 3-кратном объеме 96 % этанола в присутствии 3М раствора ацетата натрия рН 5,2, пробы оставляли на ночь при –20 °С. Препараты ДНК промывали раствором 70 %-го этанола. Полученные препараты ДНК можно хранить при –20 °C в течение месяца. Препараты ДНК/РНК и интактной ДНК анализировали, в 2 %-м агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл этидиум бромида. Электрофорез вели 1 ч при 100 B, гель фотографировали в проходящих лучах УФ.

Экспрессию мРНК исследуемого гена MDR1 определяли полуколичественным методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. Реакцию амплификации проводили по следующей схеме: денатурация – 94 °C, 10 с; отжиг – 10 с; синтез – 72 °C, 20 с. В качестве внутреннего контроля для оценки количества взятой в реакцию РНК определяли экспрессию GAPDH. Продукты полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией анализировали с помощью электрофореза в 2 % агарозном геле с добавлением 0,5 мкг/мл бромистого этидия.

Обратная транскрипция (ОТ-ПЦР)

Тотальная РНК была получена с использованием кит-набора для выделения РНК из тканей «EZ1 RNA Tissue Mini Kit» (на 48 образцов). Производитель «ИнтерлабСервис», Москва, Россия. Для получения кДНК на матрице РНК использовали кит-набор «РЕВЕРТА-L», Россия. Реакцию обратной транскрипции проводили по протоколу производителя. В работе использовали праймеры для гена MDR1, кодирующий белок лекарственной устойчивости P-гликопротеин. В качестве контроля использовали праймеры референтного гена GAPDH. ПЦР проводили на амплификаторе «BioRad» США. До проведения ПЦР, ПЦР продукты хранили при -20 °C.

Электрофорез ПЦР продуктов проводили в 2 % агарозе в ТАЕ буфере, 100 B, 1 ч. Затем агарозный гель окрашивали в течение 15 минут в растворе этидиум бромида (0,5 мкг/мл). Результаты электрофоретического анализа в геле визуально наблюдали через проходящие лучи УФ на трансиллюминаторе «Bio-Rad». Агарозный гель после электрофореза сканировали на денситометре, который анализирует интенсивность свечения ПЦР-продуктов. Полученное изображение полос обрабатывали с помощью компьютерного денситометра (Gel-Pro-Analizer 4.0).

Таблица

Последовательность праймеров, использованных в исследованиях

Результаты и обсуждение

На сегодняшний день  лечение миомы матки является наиболее трудной и дискутабельной проблемой [1, c. 64]. Выбор метода лечения определяется множеством факторов: особенностями патогенеза, формой и темпом роста опухоли, возрастом, отсутствием или наличием детей у женщины и т.д. [4, c. 856]. Задачей терапии является удаление опухоли (хирургическое лечение) либо торможение опухолевого роста и регресс новообразования (консервативное лечение).

Были обследованы 40 пациенток разной возрастной категории с различными формами миом матки. Пациентки были разделены на 3 группы: 1 – простая миома матки (12 пациенток); 2 – прогрессирующая (быстрорастущая) миома матки (18 пациенток); 3 – симптомная миома – нарушение менструального цикла, симптом кровотечения (10 пациенток). В качестве контроля – здоровые доноры (10 доноров). Критериями включения в исследование больных женщин явились: наличие миомы матки у женщин репродуктивного и пременопаузального возраста с разным развитием клинической симптоматики заболевания. Эффективность лечения больных с миомами матки зависит от индивидуальных особенностей организма, то есть от генетических факторов, которые детерминируют или определяют ответную реакцию организма на действие различных лекарственных препаратов. Нами было проведено генотипирование больных с миомами матки. Генотипирование по полиморфному маркеру С3435Т гена MDRI, имеющего наибольшее клиническое значение и представляющего собой замену в нуклеотидной последовательности в положении 3435 цитозина на тимин, позволило выявить у пациенток с миомами матки наличие следующих генотипов: гомозиготный ТТ – устойчивый, гетерозиготный СТ – среднеустойчивый и гомозиготный СС – чувствительный. Было определено, что больные, имеющие прогрессирующую (быстрорастущую) миомы матки, в основном имеют устойчивый ТТ генотип, то есть плохо отвечают на проводимую терапию. Полиморфизм С3435Т гена MDR1 представлен заменой цитозина на тимин в сайте рестрикции ферментов Sau3A или Mbo и влияет на уровень экспрессии белка Р-гликопротеина (Pgl) Предполагается, что носительство генотипа ТТ приводит к повышению экспрессии гена MDR1 [6, c. 526]. Ген MDRI – один из основных генов, отвечающих за развитие лекарственной устойчивости. Этот ген длиной 21 т.п.н. локализован на коротком плече седьмой хромосомы. Он содержит 29 экзонов и экспрессируется с образованием транскрипта длиной 4 916 н. Белок, который экспрессируется данным геном относится к АТФ-зависимым  трансмембранным белкам и имеет молекулярную массу 170 кДа. Функция белка состоит в переносе лекарственных средств и других соединений из клетки в межклеточное пространство [3, c. 361].

В настоящее время активно изучается клиническое значение 4 аллельных вариантов, представляющих собой замену в нуклеотидной последовательности ДНК одного нуклеотида на другой или полиморфизмы одного нуклеотида. Два из них (G2677T и G2677A в 21 экзоне) являются структурными полиморфизмами, то есть приводят к изменениям в аминокислотной последовательности. Полиморфизмы С1226Т (в 12 экзоне) и С3435Т (в 26 экзоне) локализованы в промоторной зоне гена MDRI и приводят к изменению его экспрессии [7, c. 538].

Анализ уровня экспрессии гена MDR1 в лимфоцитах крови

Анализ уровня экспрессии гена MDR1 в лимфоцитах крови

Рисунок. 1. Анализ уровня экспрессии гена MDR1 в лимфоцитах крови

Дорожки: N – контроль (праймеры + вода), М – маркер 100 bp, GARDH – референтный ген (интенсивность свечения в геле, ПЦР продукта, этого гена берется за 100 %, контроль), дорожки 1–18 – исследуемые образцы. Электрофорез проводили в 2 % агарозном геле, в ТАЕ буфере, 20 минут при 20 B в течение 1 часа, затем при 120 В. Гель окрашивали в водном растворе этидиум бромида (0,5 мкг/мл) 15 минут, фотографировали через проходящие УФ-лучи прибора трансиллюминатора («Bio-Rad»). Сравнивали уровень экспрессии гена MDR1 в миомах матки. Функциональную активность Р-гликопротеина, продукта экспрессии гена MDR1 изучали методом обратно-транскриптазной ПЦР. На рисунке 1 показана количественная оценка экспрессии гена MDR1 больных с миомами матки. Из данного рисунка видно, что у 9 пациенток наблюдалась высокая экспрессия гена MDR1, то есть эти больные плохо отвечают на проводимое лечение. Полученные результаты свидетельствуют о том, что у пациенток с высокой экспрессией мРНК гена MDR1 применяемая программа лечения оказывала меньшее противоопухолевое действие. Эти больные имели прогрессирующую миому матки и устойчивый ТТ генотип.

Известно, что каждый человек индивидуально реагирует на действие тех или иных лекарственных средств  и эта индивидуальность детерминирована его генетическим профилем. Более широко можно сказать, что фенотипическое проявление реакции на лекарственные средства обусловлено генетическим профилем конкретного индивида, реализованным под воздействием внешних факторов [8, c. 47]. При лечении миом матки необходимо учитывать множество факторов, влияющих на переносимость лекарственных препаратов. У каждой больной эффективность одного и того же препарата может быть разной, что связано с генетически детерминированными индивидуальными особенностями метаболизма лекарственных препаратов, наличием сопутствующей патологии и других факторов, влияющих на эффективность лечения. Одним из таких факторов может быть изученная в данном исследовании устойчивость миоматозных клеток к действию препаратов. Безусловно, у человека метаболизм лекарственных препаратов является многофакторным процессом, и ответ организма на введение лекарственных препаратов индивидуален для каждого больного.

Выводы:

1. Проведен анализ экспрессии гена MDR1 при лечении различных миом матки.
2. Показано, что повышение экспрессии гена MDR1 в процессе терапии является неблагоприятным прогностическим признаком агрессивности течения заболевания, обусловливает отсутствие ответа на проводимую терапию.