Экспериментальные исследования сравнительной эффективности гемо-, плазма- и асцитособции при печеночной недостаточности

АННОТАЦИЯ

Печеночная недостаточность остается сложной проблемой современной медицины в силу многих вопросов профилактики и лечения. Высокий уровень патологических метаболитов часто ассоциируется с полиорганной дисфункцией. Дисбаланс между физиологическими нуждами и функциями поврежденной печени приводит к таким тяжелым жизнеугрожающим осложнениям печеночной недостаточности, как желтуха, холестаз, асцит, почечная недостаточность, кровотечение, иммунные нарушения, печеночная энцефалопатия, кома, и даже смерть. Экстракорпоральные методы поддержания функции печени были разработаны для стабилизации пациентов, в качестве «бридж-терапии» к трансплантации печени, либо для восстановления функций печени. Активированный уголь может быть использован для различных методов очищения крови в лечении множества заболеваний, в том числе печеночной недостаточности. Были описаны недавние in vitro модели гемо- и плазмаперфузии. В данном исследовании были исследованы возможности гранулированного активированного угля при использовании цельной крови, плазмы и асцитической жидкости. Основные молекулы-мишени были представлены общим билирубином, прямым билирубином, АЛТ, АСТ. Результаты показали ограничение эффективности гемоперфузии временным фактором контакта с кровью. Исследованиями при помощи световой микроскопии установлены признаки повреждения эритроцитов и гемолиз. Наиболее высокая сорбционная способность была зарегистрированна при плазмаперфузии с наиболее низкой скоростью протекания через сорбент.

ABSTRACT

The liver failure remains a major problem of modern medicine due to many prophylaxis and treatment issues. High level of pathologic metabolites is associated with multiply organ dysfunction. The imbalance between the physiological needs and the functions provided by the injured liver results in severe life-threatening complications of liver insufficiency such as jaundice, cholestasis, ascites, renal failure, bleeding, immune disorders, hepatic encephalopathy, coma and even death. Extracorporeal liver support devices have therefore been developed in order to stabilize the patient and either act as a bridge to liver transplantation or allow the liver to recover from injury. Activated carbon can be used for different blood purification methods to treat a lot of conditions including liver failure. Recent in vitro models of hemo- and plasmaperfusion were described. The possibility of granular activated carbon using whole blood, blood plasma, and ascites fluid was investigated in the current study. The main target molecules were presented by total bilirubin, direct bilirubin, ALT, AST. The results showed effectiveness of hemoperfusion was limited by the contact time with blood. Signs of erythrocytes membrane damage and hemolysis were established using the light microscopy. The highest sorption capacity was registered during the plasmaperfusion at low flow rate. 

В настоящее время поддержание функции печени при печеночной недостаточности имеет особую актуальность и остается одним из трудных проблем в гепатобилиарной хирургии. Методы очищения крови и плазмы активно стали использоваться для лечения гипербилирубинемии только в последние два десятилетия. Данное направление стало именоваться небиоартифициальной печенью для различения от термина «биоартифициальная печень».  Небиоартифициальная печень – это главная альтернатива в очищении крови при гипербилирубинемии, который включает в себя гемоперфузию, плазмоперфузию, гемодиализ, молекулярную адсорбционную рециркулирующую систему и т.д.[9].  

Механизм развития и прогрессирования гипербилирубинемии при печеночной недостаточности остается предметом изучения многих исследователей. Известно, что билирубин имеет гидрофобные свойства до того, как он конъюгируется с глюкуроновой кислотой. Образованные моно- и диглюкурониды обладают гидрофильностью, что способствуют их переносу через каналикулярные мембраны гепатоцитов в желчь [3]. Однако транспорт представляется невозможным при патологиях печени, сопровождающихся нарушением анионного транспорта глюкуронидов, который осуществляется посредством специфического транспортирующего полипептида 2, 1В1, 1В3 [6, 7]. Купферовские клетки при печеночной недостаточности (при холестазе, стеатозе, гепатите, нарушении перфузии ткани печени) высвобождают цитокины, которые также ингибируют выхождение конъюгированного билирубина в желчные протоки, в результате чего происходит накопление глюкуронидов в крови. [14, 21].

Исследования E. Lang и др. экспериментально (in vitro, in vivo и ex vivo) показали, что при увеличении уровня конъюгированного билирубина крови стимулируется апоптоз эритроцитов (эриптоз), т. е. программирование гибели красных кровяных телец. Так на 3-ей неделе после перевязки желчного протока у лабораторных мышей отмечалось резкое снижение количества эритроцитов, гемоглобина и гематокрита, но в то же время число ретикулоцитов заметно возросло. При введении меченых эритроцитов здоровых животных обеим группам период их полураспада был короче в опытной группе мышей с обструкцией желчных путей по сравнению с контрольной. Было так же выявлено, что снижение концентрации альбумина в крови усугубляет токсическое действие глюкуронидов на эритроциты. Критическим уровнем прямого билирубина, при котором отмечаются начальные признаки эриптоза, принято считать выше 50 мкмоль/л.[15].

Таким образом, анемия среди пациентов с печеночной недостаточностью вследствие кровотечений из варикозно расширенных вен пищевода, вирусной инфекции может усугубляться воздействием высоких концентраций прямого билирубина в крови.[12, 16, 17].

Адсорбция – метод удаления молекул из крови или плазмы, основанный на присоединении этих молекул к поверхности специального устройства в пределах экстракорпорального контура. [3]. Сорбенты – субстанции, которые благодаря своим физическим и химическим характеристикам адсорбируют на своей поверхности элементы или вещества раствора (адсорбаты). В медицине сорбенты используются для быстрой элиминации как промышленных, фармакологических токсинов, также и некоторых эндогенных токсинов (билирубин, порфирины). Сорбенты можно условно разделить на 2 большие категории. 1) имеющие гидрофобные свойства, следовательно, адсорбирующие патологические молекулы при непосредственном контакте с ними. 2) сорбенты, удаляющие субстанции посредством химического сродства.[5].

Активированный уголь является сорбентом широкого спектра, эффективно удаляющий эндотоксины, лейкоцитарный ингибирующий фактор, цитотоксины, подавляющие регенерацию клеток печени, ароматические аминокислоты, гидроксибензин, индол и коротко-цепочные жирные кислоты, а также билирубин. [20].

Целью исследования явилась экспериментальная оценка эффективности гемадсорбции, плазмадсорбции и асцитосорбции при циррозе печени  с портальной гипертензией в условиях «in vitro».

 Материал и методы исследования.

Объектом исследований явились образцы крови и асцитической жидкости 28 пациентов с циррозом печени, осложненным портальной гипертензией. Забор крови и асцитической жидкости осуществлялся во время лечебных и диагностических манипуляций с согласия пациентов. Больные были осведомлены об основных целях и задачах данного исследования.

Описание модели исследований  «in vitro»

В качестве исследуемого раствора была взята цельная кровь  у пациентов с различной степенью печеночной недостаточности, циррозом печени в количестве до 100 мл. Для проведения исследований эффективности плазмадсорбции в образцы крови было добавлено 5000 ЕD гепарина, после чего кровь центрифугировалась при относительной центробежной силе RCF от 1000 до 1200 xg в течение 30 минут.

Все сорбционные методы были проведены при помощи угольного сорбента марки СКН-2к (Киев, Украина) со средним диаметром гранул 0,3 – 0,6 мм, удельной поверхностью мезопор 1230 м²/г. Содержание рабочей фракции составляла не менее 90 % от общей массы, насыпная масса в 1 куб. см – неболее 0,38 г, запыленность - не более 5 %. Нами было выбрано объемное соотношение сорбента и плазмы 1:2. Следует отметить, что цельная кровь и плазма для исследования были взяты исходя из одинаковых объемов плазмы. Лабораторные исследования проводились до и после экспериментов.

Биохимические исследования проводились на биохимическом анализаторе Vitros 350 (Германия). Перед гемадсорбцией проводилась подготовка гранул СКН-2к. 35 г угольного сорбента однократно обрабатывалось гепаринизированным раствором (5000 ЕD гепарина с добавлением 100 мл физиологического раствора). Далее было пропущено через сорбционную систему 100 мл крови со скоростью 10, 30 и 50 мл/мин. Все опыты проводились при комнатной температуре. Для каждой скорости перфузии были взяты отдельные образцы крови.

Для изучения плазмадсорбции 35 г СКН-2к было отмыто 50 мл физиологического раствора. Гранулы угольного сорбента не подвергались обработке гепаринизированным раствором, так как отсутствовал риск повреждения красных кровяных клеток. Через сорбционную колонку было перфузировано 50 мл плазмы со скоростью 10, 30 и 50 мл/мин. При этом также для каждого исследования были использованы новые образцы плазмы и сорбента.

Данная методика отличается простотой проведения, высокой воспроизводимостью, условиями, приближенными к таковым при проведении экстракорпоральной детоксикации. Выбранные скорости карбоперфузии соответствуют экспериментальным и клиническим данным отечественной и зарубежной литературы.

Методы исследований

Определение среднемолекулярных пептидов в асцитической жидкости

«Средние молекулы» определяли в асцитической жидкости с помощью скрининг-метода, основанного на элюции 10-процентным раствором ТХУК компонентов, молекулярная масса основного пула которых составляет около 1000 Дальтон. После центрифугирования при 8000 об/мин детекцию осадка проводили при 570 нм на аппарате фотоколориметра КФК. Полученные значения выражали в условных единицах, равных величине экстинции.

Определение лактата в асцитической жидкости

Содержание лактата определяли с помощью набора реактивов фирмы «Берингер» (Германия). Принцип метода основан на энзиматической реакции, катализируемой лактатдегирогеназой при pH = 9,0. Учитывая повышение оптической плотности в результате восстановления НАД, эквивалентное количеству лактата в пробе, проводят измерения. Количественную оценку определяли на фотоколориметре КФК при длине волны 340 нм относительно воздуха. Результаты представлены в ммоль на 1 л.

Морфологические методы исследований в процессе гемо-, плазма- и асцитосорбции

Причиной гемолиза эритроцитов может стать высвобождение токсических веществ с поверхностей экстракорпорального контура, либо активация тромбоцитов и лейкоцитов. В конечном итоге это вызывает разрушение мембран красных кровяных клеток и выход свободного гемоглобина в плазму. [8]

Забор крови осуществляли после выхода из колонки после каждого сеанса гемадсорбции. Экспресс-методику «толстой капли» осуществляли следующим образом. Полученную кровь собирали в стерильную пробирку с фиксатором в количестве 0,5 мл (10 капель). Получаемое небольшое количество крови набирали в стерильную пробирку с фиксатором – 2 мл 2,5% раствора глютарового альдегида. После окончания сбора крови приступали к морфологическому анализу непосредственно либо спустя некоторое время, учитывая условия. Перед приготовлением препарата пробирку встряхивали. На предметное стекло капали 2 капли суспензии фиксированных неокрашенных эритроцитов. На ограниченном участке предметного стекла формировали полусферическую каплю с поверхностным натяжением, на которую горизонтально опускают покровное стекло. Это позволило смоделировать свободное движение эритроцита крови внутри просвета сосуда, где эритроцит находится во взвешенном состоянии между потоками в толще суспензии. Подготовленные препараты исследовали с помощью световой микроскопии без иммерсии в прямом проходящем свете при помощи микроскопов Биолам И, Биолам И2. Подсчёт соотношения форм эритроцитов проводили при увеличении 10х60 при выборке не менее 1000 эритроцитов на каждый  этап и срок исследования, фиксируя полученное на камеру цифрового фотоаппарата «Canon» с дальнейшим сохранением данных на компьютере Pentium - IV с  помощью прикладных программ ExсelOfficeMicrosoft «Windows-XP». Также имелась возможность сохранения полученных изображений не только в фото, но и в видео формате, что полезно при исследовании изменчивости форм эритроцитов в сдвиговом потоке, который они испытывают, находясь внутри просвета сосуда. [1]

Результаты исследований.

Оценка клеточной деструкции при гемосорбции.

Экспериментальная модель гемадсорбции закючалась в прохождении гепаринизированой крови через сорбционную колонку с различной скоростью перфузии: от 10 до 50 мл/мин. На выходе из сорбционной колонки при всех скоростях перфузии не были выявлены признаки гемолиза эритроцитов по данным макроскопических и биохимических исследований. Для более объективной оценки степени повреждений эритроцитов, нами проведены исследования на светооптическом уровне методом «толстой капли» (Байбеков И.М. . и др., 2006 г.). Установлено, что в зависимости от скорости прохождения крови наступали изменения в структуре мембран эритроцитов. В первом препарате, взятом при скорости 10 мл/мин, не было отмечено существенных признаков повреждения мембран эритроцитов (Рис. 1А). Во втором препарате (30 мл/мин) отмечалось около 25% эритроцитов с обратимыми и необратимыми формами в поле зрения, а в третьем (50 мл/мин) – до 40% эритроцитов имели необратимые изменения мембран (Рис. 1Б, В). Согласно показателям нормы, разработанным в лаборатории патологической анатомии АО «РСЦХ им. акад. В. Вахидова» отмечались следующие необратимые формы эритроцитов: в виде тутовой ягоды, спущенного мяча, сферические. Признаки гемолиза были обнаружены и при пассивном стекании крови через мини-колонку с сорбентом, несмотря на то, что гранулы угольного сорбента были обработаны раствором гепарина.

Рисунок 1. Световая микроскопия эритроцитов после контакта с гемосорбентом (УВ 10х60) 

А – при скорости 50 мл/мин (форма эритроцитов изменена незначительно); Б – при скорости 30 мл/мин (появились необратимо поврежденные формы); В – при скорости 15 мл/мин (больгшая часть эритроцитов имеет необратимые повреждления).

Результаты гемадсорбции

При гемадсорбции со скоростью 50 мл/мин уровень общего белка снизился на 10.6±2.8%, 30 мл/мин – на 13.8±3.1%, 10 мл/мин – на 17.2±1.29%  (n = 15). Уровень общего белка снизился с 57,2±0,33 г/л до 47,2±0,73 г/л, что составило в среднем снижение на 17% (р<0,05). Также наблюдалось достоверное снижение АЛТ, АСТ: при гемадсорбции 50 мл/мин снизижение соответствующих показателей на 8.3±3.4%, 10.8±1.92, 30 мл/мин - 9.9±2.1%, 14.7±3.13%, 10 мл/мин - 11.9±1.12%, 19.1±1.17%. Разница между показателями снижения АЛТ в разных временных промежутках не была достоверно значимой в относительных и абсолютных значениях. Концентрация общего билирубина в крови по окончании сорбции уменьшилась на  6.9±2.8%, 17.3±2.22%, 23.3±1.65%; прямого билирубина – на 13.5±1.8%, 20.8±2.1%, 25.3±1.75%; непрямого билирубин – на 16,4% , соответственно после гемадсорбции 50 мл/мин, 30 мл/мин, 10 мл/мин. (Табл. 1, Диаграмма 1).

Диаграмма 1. Показатели фракций билирубина (мкмоль/л) в динамике при гемадсорбции

Таблица 1.

Снижение (%) показателей в результате 1-, 3-, 5-минутной гемадсорбции(ГС)

Результаты плазмадсорбции

Исследования эффективности плазмадсорбции (n = 10) позволили выявить тенденцию  более значимого падения уровня протеинов: при плазмадсорбции со скоростью 50 мл/мин – на 10.6±2.8%, 30 мл/мин – 16.8±3.1%, 10 мл/мин – 20,2±2.3%. (Табл. 2). Данные статистических показателей не выявили достоверной разницы ни в относительных и в абсолютных величинах относительно сорбции 30 и 50 мл/мин (р>0,05). При плазмадсорбции достигнуто относительно большее снижение уровня АЛТ и АСТ. Отмечено снижение АЛТ соответственно скорости перфузии на10.3±3.4%, 13.9±2.1%, 16.9±1.12%, то же АСТ на 18.8±1.92%, 27.7±3.13%, 32.5±1.17% (Табл. 2).

Таблица 2.

Снижение (%) показателей в результате 1-, 3-, 5-минутной плазмадсорбции (ПС)

При плазмадсорбции со скоростью 50 мл/мин достигнуто снижение общего билирубина с 39,11±2,3 до 31,4±1,7 мкмоль/л (р<0.05), прямого билирубина – с 27,3±1,8 до 21,98±2,1 мкмоль/л, непрямого билирубина – с 12,2±2,6 до 10,67±1,3 мкмоль/л (Диаграмма 2). После сорбции со скоростью 30 мл/мин уровни общего, прямого и непрямого билирубина продолжали снижаться: общий билирубин – на 27.3±2.22%, прямой билирубин - 31.8±2.1%, непрямой билирубин – на 14.8±2,5% (Табл. 2). После  плазмадсорбции со скоростью 10 мл/мин уровень общего билирубина снижался на 34.4±1.65% (p<0,05), прямого билирубина – на 39.1±1.75% (p<0,05), непрямого билирубина - 17.9±1.31% (р>0.05).

Диаграмма 2. Показатели фракций билирубина (мкмоль/л) в динамике при плазмадсорбции.

Результаты асцитосорбции

При асцитосорбции со скоростью 10 мл/мин было выявлено достоверное снижение средних молекул на 21,1%, лактатдегидрогеназы – 51,7%, щелочной фосфатазы – 44,9%, сорбит-дегидрогеназы – 60,1%, глютаматдегидрогеназы – 21,5% (p<0,05). Что касается адсорбции протеинов в асцитической жидкости (n = 8), то можно увидеть схожую картину с результатами эксперимента по плазме крови (15%) при p>0,05. (Табл. 3).

Таблица 3.

Ферментный спектр и уровень общего белка асцитической жидкости больных циррозом печени до и после асцитосорбции со скоростью 10 мл/мин.

Учитывая то обстоятельство, что сорбционные методы эффективны при достаточно высокой концентрации нежелательных метаболитов, при асцитосорбции целесообразно провести мероприятия по удалению избытка воды. В ходе наших  исследований повышение концентрированности асцитической жидкости достигалось применением ультрафильтрации (у 5 пациентов), либо проведением терапии диуретиками (у 6 пациентов). Таким образом, достигалась достаточно высокая концентрация асцитической жидкости в отношении белковой фракции.

Обсуждение.

Исследовательские группы изучают различные виды моделей invitro сорбции токсинов, которые позволяют оценить адсорбционную способность сорбентов, их биосовместимость с кровью, клетками организма. Изучение действия сорбента и механизма сорбции на различных моделях позволяет разработать технологии для усовершенствования возможностей данной методики. Для определения адсорбционной емкости в качестве растворов за рубежом используется кровь и плазма здоровых доноров, кровь животных, растворы человеческого альбумина. Адсорбатами служат специальные реагенты специфических патологических субстратов, которые производятся научными лабораториями. [13, 18, 22, 24].

К факторам, влияющим на сорбцию относятся: соотношение сорбента и исследуемого раствора (плазма, цельная кровь, асцитическая жидкость), время сорбции, скорость перфузии [8, 10, 11]. Использование экспериментальных моделей позволяет изучать влияние сразу нескольких вышеуказанных факторов.

Tao G. Et al. (2014) была предложена модель для определения адсорбционной способности модифицированного угольного сорбента. [22].  Исследования проводились в донорской плазме и растворе NaOH с добавлением искусственного билирубина, несмотря на то, что испытуемый сорбент предназначен для гемоперфузии. Сорбция выдерживалась в специальном шейкере (100 встряхиваний в минуту) при температуре 37 °С в течение 20 мин. Таким образом создавалась кинетическая сорбция в нейтральной среде (pH 7,4). Ввиду высокопористой структуры материала исследования проводились с  0,01 мг сухого сорбента на 2 мл раствора.

Гранулы сорбентов в некоторых случаях подвергались обработке изотоническим раствором, гепарином для лучшего взаимодействия с кровью и предотвращения преждевременного сворачивания крови. В растворы добавлялись также гепарин, фосфатные и другие буферные растворы для создания максимально приближенных условий in vivo. [4, 23].

При исследовании процессов гемадсорбции следует обращать внимание и на взаимодействие клеточных элементов крови с поверхностями биоматериалов экстракорпоральных систем. Может возникать адгезия эритроцитов и тромбоцитов. В пристеночных областях наибольшая скорость протекания крови и адгезированный к стенке эритроцит деформируется и может быть разрушен. Но чаще всего встречается гемолиз, который связан с механическим воздействием, как правило, со стороны инородных материалов и конструкций. В сорбционных системах он возникает вследствие прямого механического воздействия на мембрану эритроцитов, где степень гемолиза определяется не только величиной механического воздействия, но и его длительностью [1]

В одном сравнительном исследовании покрытого и непокрытого активированного угольного сорбента было изучено влияние на гемолиз эритроцитов. После выдержанной сорбции образцы крови были отцентрифугированы, плазма была выделена и оценена на наличие гемолиза спектрофотометрическим методом. Результаты показали, что достоверной разницы количественной оценки гемолиза после сорбции покрытыми и непокрытыми гранулами не наблюдалось. Хотя по остальным показателям биосовместимости были достигнуты более успешные результаты [13]. Отсюда можно сделать вывод, что повреждение мембран эритроцитов является трудно управляемым фактором в процессе гемадсорбции.

В ходе плазма- и гемадсорбции отмечалось наиболее интенсивное снижение печеночных метаболитов и общего белка при сорбции 10 мл/мин. Причем общий белок снижался с достоверной разницей при плазмадсорбции.  Вероятно, большой разброс значений обусловлен различным не только количественным, но и качественным протеиновым составом образцов плазмы крови. Можно предположить, что адсорбция более мелких белковых молекул (альбумин) происходит быстрее.

Уровень общего белка в крови занимает особое место в успехе лечения пациентов с синдромом печеночно-клеточной недостаточности. В то же время низкая адсорбирующая способность сорбентов в отношении протеинов свидетельствует о хорошей совместимости с кровью. При адсорбции протеинов в крови запускается каскадный механизм химических реакций, которые в конечном итоге могут привести к тромбообразованию. [19]. Наиболее эффективное снижение уровня АЛТ и АСТ было продемонстрировано при эксперименте плазмадсорбции.

По результатам сорбции 10 мл/мин можно отметить преимущественную активность взаимодействия сорбента именно с плазмой, несмотря на то, что объемные соотношения, время и площадь контакта были взяты абсолютно одинаковыми. По всей видимости, присутствие клеточного состава крови (адгезия, тромбообразование) тормозят сорбцию билирубина. Следует отметить тот факт, что удаление из растворов прямого билирубина происходит более определенно и достоверно в отличие от непрямого билирубина. Возможно, это связано с водорастворимостью и полярными свойствами молекул глюкуронидов и диглюкуронидов. Фактически показатели плазмадсорбции 30 мл/мин можно приравнять к таковым при плазмадсорбции 10 мл/мин. Таким образом, результат достигается быстрее в отношении всех  фракций билирубина.

Асцитосорбция (АС) применяется для возмещения потерь белка у больных с циррозом печени,  также при дренировании грудного лимфатического протока. При сохранении высокой токсичности лимфы АС выполняется во все сроки лимфодренирования (от 4 до 8 дней). Очищенная асцитическая жидкость вводится в объеме, адекватном теряемому с лимфой белку. При содержании в асцитической жидкости белка 20 г/л и ниже показана ее ультрафильтрация для достижения нужной концентрации белка и уменьшения во столько же раз объема жидкости. Асцитоперфузат подвергается карбоперфузии. Установлена эффективность реинфузии концентрата асцитической жидкости у пациентов с циррозом печени и с портальной гипертензией. Так, улучшался исход операции при предоперационной  реинфузии в составе комплексной терапии. В сочетании со спленоренальным анастомозом внутривенные вливания концентрата асцитической жидкости положительно влияли на клиническую симптоматику и белковый баланс, снижали синдром цитолиза. [2]. Общеизвестно, что действие диуретиков при циррозе печени и асците носит многогранный характер и состоит в их влиянии на почечные структуры и внепочечные механизмы регуляции водно-электролитного баланса. Применение диуретической терапии позволит добиться повышения  концентрации белковой фракции в асцитической жидкости, что сделает ее пригодной для проведения асцитосорбции с последующей аутотрансфузией.

Таким образом, применение угольного сорбента при гемадсорбции и плазмадсорбции позволяет значительно снизить уровень печеночных маркеров. Метод плазмадсорбции имеет ряд преимуществ, включая возможность пролонгирования времени сорбции и отсутствие риска повреждения мембран эритроцитов. При использовании асцитосорбции открываются возможности для безопасного восполнения белкового состава крови среди пациентов с циррозом печени, осложненном портальной гипертензией и печеночно-клеточной недостаточностью. Применение асцитосорбции оправдано с назначением антибактериальной терапии и диуретиков, что позволит повысить концентрацию протеинов в асцитической жидкости. Дальнейшее изучение данного вида экстракорпоральной детоксикации может позволить модифицировать методику в отношении сорбции протеинов, улучшения биосовместимости и эффективности сорбционных систем.