Влияние экстракта Габерлей Родопской in vitro на мононуклеарных клеток периферической крови человека

АННОТАЦИЯ

Введение. Габерлея родопская (Haberlea rhodopensis Friv., HR) – многолетнее растение из рода Gesneriaceae, субсемейства Didymocarpeae. Этот вид – реликт доледниковой эпохи, а также и балканский эндемичный вид, распространённый в Болгарии, прежде всего в лесах Родопы и в некоторых областях Старoй планины. Установлено, что тотальный экстракт габерлеи проявляет антибактериальную, антикластогенную, антигенотоксичную и антиоксидантную активность.

Цель данного исследования – сравнительное исследование цитотоксичности тотального экстракта из габерлеи родопской in vitro в культуре мононуклеарных клеток периферической крови методом МТТ-теста и теста на выживаемость при окраске трипановым синим.

Материал и методы. Способ получения экстракта листьев габерлеи: предварительно высушенные и измельченные листья были мацерированы 70 % этиловым спиртом в течение 48 часов с последующей дистилляцией спирта в вакуумном испарителе до соотношения сырья/жидкой фазы 1:1. Мононуклеарную фракцию клеток выделили из крови 7 здоровых людей обоего пола в возрасте от 22 до 40 лет методом центрифугирования в градиенте плотности препарата Histopaque®-1077. Выделенные клетки культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением L-глутамина, 10%-й эмбриональной телячьей сыворотки, 1 % по объему смеси антибиотиков и антимикотиков и растительного экстракта габерлеи в течение 12 ч. Для изучения действия экстракта использовали 5 концентраций – 65 мкл/мл, 26 мг/мл, 13 мг/мл, 1,3 мг/мл, 0,13 мг/мл и контроль без экстракта.

Результаты. Установлено, что экстракт габерлеи вызывает дозозависимый ответ клеток в культуре. Вычислена IC50=10,4 мкл/мл в тесте на выживаемость при окраске трипановым синим.

ABSTRACT

Introduction. Haberlea rhodopensis (Haberlea rhodopensis Friv, HR.) is a perennial plant of the family Gesneriaceae, subfamily Didymocarpeae. This type is a relic of the pre-glacial era, as well as Balkan endemic species, common in Bulgaria, especially in the forests of the Rhodope and in some areas of Stara Planina. It is found that the total extract of haberlea exhibits antibacterial, anticlastogenic, antigenotoxic and antioxidant activity.

The aim of research - a comparative study of the cytotoxicity of total haberlea rhodopensis in vitro extract in a culture of peripheral blood mononuclear cells by MTT-test and trypan blue exclusion assay.

Material and methods. A method for preparing an extract of haberlea leaves: pre-dried leaves are crushed and macerated with ethanol 70 % during 48 hours followed by distillation of the alcohol in a vacuum evaporator to a drug / liquid phase proportion of 1: 1. Mononuclear cell fraction is isolated from the blood of seven healthy people of both sexes aged 22 to 40 years old by density gradient centrifugation Histopaque®-1077. The isolated cells are cultured in RPMI-1640 medium supplemented with L-glutamine, 10 % fetal bovine serum, 1 % by volume of a mixture of antibiotics and antimycotics and haberlea plant extract during 12 hours. To study the action of the extract, 5 concentrations are used – 65 mcl/ml, 26 mg/ml, 13 mg/ml, 1.3 mg/ml, 0,13 mg/ml, and control without extract.

Results. It was established that the haberlea extract causes a dose-dependent response of cells in culture. IC50 = 10,4 mcl / ml is calculated in the test on the survival with trypan blue staining.

Введение

Габерлея родопская (Haberlea rhodopensis Friv., HR) – многолетнее растение из рода Gesneriaceae, субсемейства Didymocarpeae. Этот вид – реликт доледниковой эпохи, а также и балканский эндемичный вид, распространённый в Болгарии, прежде всего в лесах Родопы и в некоторых областях Старoй планины. HR относится к так называемым resurrection plants – «воскреснувшим», или восстанавливающимся растениям. При неблагоприятных внешних условиях выпадает в анабиоз (до 31 месяца), но при наступлении благоприятных условий жизни снова возобновляет свои жизненные процессы [1, с. 150].

HR в последние годы усиленно изучается. Из экстрактов HR обнаружены гликозиды муконозид и паусцифлосид, хиспидулин С-гликозиды, аминокарбоновые кислоты, жирные кислоты, феноловые кислоты (сиринговая кислота, ванилиновая кислота, кофейная кислота, дигидрокофейная кислота и др.), фитостеролы, глицериды и др. [7, с. 21; 8, с. 38; 9, с. 215]. Несколько групп ученых нашего института тоже исследовали габерлею. На белых лабораторных мышах была изучена острая и хроническая токсичность тотального экстракта. Была определена ЛД50=14,8 ml/kg для мышей при внутрибрюшинном введении [6, с. 78]. Обнаружена антибактериальная активность [10, с. 34], антикластогенная, антигенотоксичная и антиоксидантная активность тотального экстракта HR [6, с. 199–200].

Прежде чем продолжить дальнейшее изучение биологических активности экстракта и его молекулярных и клеточных механизмов, важно изучить и его цитотоксичность. Проявления токсического процесса на клеточном уровне сказывается структурно-функциональными изменениями клетки (изменение формы, сродства к красителям, подвижности и т. д.), преждевременной гибелью клетки (некроз, апоптоз) и мутациями (генотоксичность) [5, с. 119]. Модели in vitro с использованием культур клеток и биохимических показателей на клеточном уровне все более применяется в биохимико-токсикологических исследованиях. Они имеют ряд преимущества: более дешевые; привлекательные с этической точки зрения, поскольку они существенно уменьшают использование животных [4, с. 256]. Работа непосредственно на культурах клеток человека делает полученные данные более адекватными при их проекции на организм человека, преодолевая значительное количество видовых различий в метаболизме. Кроме того, использование культур клеток позволяет установить характер биологической активности изучаемых соединений непосредственно на клеточном уровне и учесть сложные синергетические и/или разнонаправленные эффекты смесей химических соединений [2, с. 3]. Кроме того, известно, что первичные клеточные культуры имеют морфологические и биохимические характеристики ближе всего к исходному органу или ткани, и они более чувствительны к воздействиям токсичных веществ по сравнению с клеточными линиями [11, с. 78].

Поэтому, а также в связи с актуальностью исследований действия HR на клеточном уровне, в качестве объекта нашего исследования мы выбрали мононуклеарные клетки (МНК) периферической крови человека.

Цель работы – сравнительное исследование цитотоксичности тотального экстракта из габерлеи родопской in vitro в культуре мононуклеарных клеток периферической крови методом МТТ-теста и теста на выживаемость при окраске трипановым синим.

Материалы и методы исследования

Экстракт и реактивы. Тотальный экстракт листьев габерлеи был любезно предоставлен доцентом Б. Поповым. Предварительно высушенные и измельченные до порошкообразного состояния листья были мацерированы 70 % этиловым спиртом в течение 48 часов. Затем спиртовую и основную часть водной фаз отгоняли в вакуумном испарителе до соотношении сырья/жидкой фазы 1:1. Определённое количество экстрагированных веществ составляло 100 мг/мл [6, с. 74–75].

Histopaque®-1077, питательная среда RPMI-1640, термоинактивированная фетальная телячья сыворотка (ФТС), смеси антибиотиков и антимикотиков, МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид) и краситель трипановый синий были приобретены у компании Sigma Aldrich.

Выделение и культивирование клеток. Мононуклеарную фракцию клеток (моноциты и лифоциты) выделили из крови 7 здоровых людей обоего пола в возрасте от 22 до 40 лет. Мононуклеарные клетки выделяли методом центрифугирования в градиенте плотности препарата Histopaque®-1077. Затем МНК культивировали в культуральных флаконах в среде RPMI-1640 с добавлением L-глутамина, 10%-й эмбриональной телячьей сыворотки, 1 % по объему смеси антибиотиков и антимикотиков и растительного экстракта габерлеи. Для изучения действия экстракта использовали 5 концентраций – 65 мкл/мл, 26 мг/мл, 13 мг/мл, 1,3 мг/мл, 0,13 мг/мл, и контроль без экстракта. Клетки инкубировали при 37 ˚С в атмосфере с 5 % СО₂ в течение 12 ч. После 12 ч. инкубации их тщательно троекратно промывали фосфатным буфером путем центрофугирования при 1000 об/мин в течение 10 мин. Затем проводили МТТ- тест и тест на выживаемость при окраске трипановым синим.

МТТ-тест. Принцип теста основан на способности митохондриальных дегидрогеназ жизнеспособных клеток конвертировать водорастворимый МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид) в нерастворимое вещество – формазан, имеющий вид синих кристаллов, которые потом растворяются с помощью органических растворителей и отсчитываются фотометрием. Для проведения теста в каждую лунку 96-луночного планшета вносили по 100 мкл из каждой клеточной культуры, добавляли 20 мкл раствора МТТ (5 мг/мл) и инкубировали при 37 ˚С в течение 3 ч. После инкубации в каждую лунку добавляли 100 мкл закисленного изопропанола (0,04 N HCl в абсолютном изопропаноле). Оптическую плотность растворов затем определяли на планшетном ридере Мультискан ЕХ (Термо Электрон, Германия) при длине волны 570 нм и 620 нм. Процентное содержание живых клеток вычисляли по формуле: (ОПэкс/ОПконтр)x100, где ОПэкс – оптическая плотность экспериментальной лунки, ОП контр – оптическая плотность контрольной лунки.

Тест на выживаемость при окраске трипановым синим. Этот тест учитывает лишь состояние цитоплазматической мембраны – интактна она или повреждена. Его проводили по методикам, описанным в книге «Лимфоциты. Методы» [3, с. 50]. В лунку панели для микротитрования вносили равные объемы (по 10 мкл) клеточной суспензии и 0,4 % раствора трипаного синего. Ресуспендировали клетки пипетированием и вводили клеточную взвесь в гемоцитометрическую камеру. Затем подсчитывали не менее 100 клеток, отмечая голубые (погибшие) и неокрашенные (живые).

Статистический анализ. Результаты были представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Для оценки статистической достоверности различий между соответственными средними значениями использовали непараметрический дисперсионный анализ Крускала–Уоллиса. За достоверные принимали различия средних величин при р<0,05. Обработка данных проводилась с использованием пакета программ STATISTICA 6.0 (StatSofInk., США).

Результаты и их обсуждение

Результаты изучения влияния экстракта представлены на рисунке 1.

Рисунок 1. Эффект экстракта габерлеи на культурах мононуклеарных клеток периферической крови

Величины обо́их тестов (MTT-тест и тест на выживаемость при окраске трипановым синим) хорошо совпадают и между ними нет статистически значимой разницы (р>0,05).

Результаты исследования показали, что экстракт вызывает дозозависимый ответ клеток в культуре – тенденция к увеличению цитотоксического эффекта HR повышением концентраций (рис. 1). Величины контрольных проб и этих при концентрации 0,13 мкл/мл экстракта близки и не имеют статистически достоверной разницы (р>0,05). Была определена IC50 (средняя ингибиторная концентрация) в тесте на выживаемость при окраске трипановым синим, которая составляла приблизительно 10,4 мкл/мл. В диапазоне концентраций HR от 0 до 26 мкл/мл в МТТ-тесте вычисленная IC50 была 9,75 мкл/мл. Наблюдаемое статистически достоверное отклонение от общей тенденции проявлялось лишь при высоких показателях МТТ-теста при концентрации 65 мкл/мл экстракта. Они, конечно, могут быть обусловлены селективным ингибированием митохондриальных дегидрогеноз в меньше степени при этой концентрации, но для более точной интерпретацией необходимо проведение более широкого исследование.

Заключение

Проведено сравнительное изучение цитотоксического влияния экстракта из листьев габерлeи родопской in vitro на мононуклеарные клетки периферической крови человека в диапазоне концентраций от 0,13 до 65 мкл/мл. Полученные результаты углубляют и расширяют представление о влиянии тотального экстракта листьев габерлеи родопской и имеют практическое значение для специалистов, изучающих биологические эффекты растительных экстрактов in vitro и их молекулярные и клеточные механизмы воздействия в условиях in vitro.