РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДА ВЭЖХ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОФЕИНА

УДК 615.31:547

АННОТАЦИЯ

В работе представлена разработка и валидация метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для количественного определения кофеина в новой лекарственной форме. Хроматографическое разделение осуществлялось на колонке C18 при использовании подвижной фазы ацетонитрил – вода (10:90, об./об.) с подкислением до pH 3,0. Метод валидирован по параметрам специфичности, линейности, точности, прецизионности, чувствительности и устойчивости. Показано, что метод обеспечивает стабильные времена удерживания, симметричные пики и надежное разделение кофеина от примесей и продуктов деградации. При валидации получены коэффициент корреляции выше 0,999, предел обнаружения около 2,6 мг/л и предел количественного определения около 8 мг/л; относительное стандартное отклонение результатов повторяемости и промежуточной прецизионности не превышало 1 %, а относительное извлечение составило 98,8–101,3 %. Разработанный метод может использоваться для рутинного контроля качества, испытаний стабильности и количественного анализа препаратов, содержащих кофеин.

ABSTRACT

This paper describes the development and validation of a high‑performance liquid chromatography (HPLC) method for the quantitative determination of caffeine in a new pharmaceutical formulation. Separation was achieved on a C18 column using an acetonitrile–water mobile phase (10:90, v/v) adjusted to pH 3.0. The method was validated with respect to specificity, linearity, accuracy, precision, sensitivity and robustness. It provided stable retention times, symmetrical peaks and reliable resolution of caffeine from impurities and degradation products. Validation results demonstrated a correlation coefficient greater than 0.999, a limit of detection of about 2.6 mg/L and a limit of quantification of about 8 mg/L; the relative standard deviation of repeatability and intermediate precision did not exceed 1 % and the recovery ranged from 98.8 % to 101.3 %. The method can be applied for routine quality control, stability testing and quantitative analysis of caffeine in pharmaceutical products.

Ключевые слова: ВЭЖХ, кофеин, количественное определение, валидация метода, хроматография, фармацевтический анализ.

Keywords: HPLC, caffeine, quantitative determination, method validation, chromatography, pharmaceutical analysis.

Введение. Разработка и валидация аналитических методов играют решающую роль в обеспечении безопасности, эффективности и стабильного качества фармацевтических продуктов. Кофеин, или 1,3,7‑триметилксантин, представляет собой природный алкалоид, который широко используется в напитках, лекарственных средствах и биологически активных добавках. Этот стимулятор оказывает поведенческое и психотропное воздействие, сходное с действием психомоторных стимуляторов, и его концентрацию необходимо строго контролировать, поскольку передозировка может привести к побочным эффектам и повышенному риску для здоровья. Для определения содержания кофеина применяются различные аналитические методы, включая капиллярную электрофорез, газовую хроматографию, ультрафиолетовую спектрофотометрию и электрохимические методы; однако именно ВЭЖХ наиболее широко используется благодаря высокой точности, чувствительности и возможности отделять кофеин от структурно сходных алкалоидов.

Важным аспектом разработки хроматографического метода является выбор длины волны детектирования. Ультрафиолетовый спектр кофеина имеет два максимума поглощения — на 204 нм и 272 нм. Для ВЭЖХ обычно выбирают вторую максимум, поскольку многие растворители и буферные растворы поглощают свет в диапазоне до 230 нм, а детектирование на 272 нм обеспечивает высокую чувствительность и стабильность сигнала. Рекомендуется использовать смесь ацетонитрил – вода с добавлением фосфорной кислоты для обеспечения прозрачности подвижной фазы и стабильности pH ≈ 3.

Для установления строгих критериев соответствия применяются требования Международного совета по гармонизации (ICH Q2(R1)), которые предусматривают оценку специфичности, точности, прецизионности, линейности, диапазона, пределов обнаружения и количественного определения, а также устойчивости. Согласно этим рекомендациям, коэффициент корреляции для линейности должен быть не ниже 0,995, а относительные стандартные отклонения результатов повторяемости и промежуточной прецизионности не должны превышать 2 %. Данные требования учитывались при разработке описанного метода.

Рисунок 1. Структурные модели кофеина: плоская химическая формула, шаростержневая модель и пространственно-заполненная модель молекулы

Материалы и методы

Реагенты и стандарты.

В качестве исходного вещества использовали стандартный образец кофеина (чистота > 99 %). Для приготовления подвижной фазы использовали ацетонитрил (HPLC‑grade), двузамещённый гидрофосфат калия, фосфорную кислоту и деионизированную воду.

Хроматографическая система.

Анализ проводили на ВЭЖХ‑системе с фотодиодным детектором. Разделение осуществляли на обращённо‑фазовой колонке C18 (250 × 4,6 мм, 5 мкм) при температуре 30 °C. Подвижная фаза представляла собой смесь ацетонитрил – вода (10:90, об./об.) с добавлением фосфорной кислоты до pH 3,0; скорость потока составляла 1,0 мл/мин; объём инжекции — 20 мкл; детектирование производилось на длине волны 272 нм.

Приготовление растворов.

Исходный раствор кофеина готовили в подвижной фазе и разбавляли для получения стандартов, соответствующих 10–200 % от целевой концентрации. Образцы лекарственной формы растворяли в подвижной фазе, подвергали ультразвуковой обработке для полного растворения и фильтровали через мембранный фильтр (0,45 мкм). Это обеспечивало отсутствие посторонних частиц и гарантировало стабильную форму пиков. Для калибровочных кривых отбирали пять точек (20, 40, 60, 80 и 100 мг/л), строили график зависимости площади пика от концентрации и вычисляли коэффициент корреляции линейной регрессии.

Оптимизация условий.

Для выбора оптимальной подвижной фазы и стационарной фазы оценивали различные сочетания ацетонитрил–вода и метанол–вода, а также колонки C18, C8 и фенилсвязанные. Лучшее разделение достигалось при использовании колонки C18 и смеси ацетонитрил – вода (10:90, pH 3,0), обеспечивавшей симметричные пики и приемлемое время удерживания. Другие составы либо приводили к ухудшению формы пика, либо увеличивали время анализа.

Таблица 1.

Параметры хроматографического метода», содержащую параметры колонки, подвижной фазы, скорости потока, длины волны, температуры и объёма инжекции

Валидация.

Валидацию проводили в соответствии с рекомендациями ICH Q2(R1). Специфичность оценивали путём анализа холостого раствора, растворов плацебо и образцов после вынужденной деградации (кислой, щелочной, окислительной, термической и фотолитической). Во всех случаях кофеин хорошо отделялся от продуктов деградации, что подтверждало отсутствие помех. Линейность оценивали по пяти уровням стандартов; коэффициент корреляции (R²) превышал 0,999, что удовлетворяет требованиям ICH .

Точность определяли методом добавок; извлечение составило 98,8–101,3 %. Прецизионность оценивали как повторяемость и промежуточную прецизионность; относительные стандартные отклонения не превышали 1 %. Предел обнаружения и предел количественного определения, рассчитанные по формулам 3,3 σ/β и 10 σ/β, составили 2,6 и 7,9 мг/л соответственно. Устойчивость метода проверяли при вариациях pH, состава подвижной фазы и скорости потока; существенного изменения времени удерживания или площади пика не наблюдали, что свидетельствует о робастности метода.

Результаты и обсуждение

В оптимальных условиях смесь ацетонитрил – вода (10:90, pH 3,0) обеспечивала время удерживания кофеина около 4,7 мин и высокое разрешение. Для состава ацетонитрил – вода (20:80) время удерживания составляло 2,9 мин, но разрешение было плохим, тогда как метанол – вода (30:70) давал широкие пики и время удерживания 7,8 мин. Таблица 2 обобщает сравнительные результаты. Лучшая симметрия пиков и высокая воспроизводимость наблюдались для колонки C18, тогда как C8 и фенилсвязанные фазы демонстрировали более низкую эффективность. Результаты вынужденной деградации показали, что кофеин устойчив при различных стрессовых воздействиях и его пик хорошо отделяется от продуктов деградации. Валидационные испытания продемонстрировали превосходную линейность (R² > 0,999), что превышает минимальное требование ICH (R² ≥ 0,995). Относительные стандартные отклонения повторяемости и промежуточной прецизионности были значительно ниже рекомендуемых 2 %. Среднее извлечение варьировало в пределах 98,8–101,3 %, что подтверждает высокую точность. Низкие пределы обнаружения и количественного определения позволяют надёжно выявлять кофеин на уровне нескольких миллиграммов на литр.

Таблица 2.

Сравнение различных составов подвижной фазы и их влияния на форму пика, время удерживания и разрешение

Таким образом, разработанный метод удовлетворяет всем основным требованиям валидации и превосходит минимальные критерии, изложенные в руководстве ICH Q2(R1). Его можно рекомендовать для рутинного контроля качества серий, оценки равномерности содержания, испытаний растворения и анализа стабильности фармацевтических препаратов, содержащих кофеин. В дальнейшем для повышения экологической безопасности возможно рассмотреть альтернативные экологичные растворители (например, этанол–вода) и колонки с пентафторфенильным неподвижным фазой, которые показывают улучшенное удерживание и селективность при определении кофеина и родственных метилксантинов.

Заключение

Разработан и валидирован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для количественного определения кофеина в лекарственных препаратах. Метод использует колонку C18 и подвижную фазу ацетонитрил – вода (10:90, pH 3,0) и удовлетворяет строгим международным требованиям к валидированным аналитическим процедурам. Результаты показали, что метод обладает высокой специфичностью, линейностью (R² > 0,999), точностью и прецизионностью (RSD < 1 %), а также низкими пределами обнаружения и количественного определения. Он устойчив к изменениям условий анализа и способен эффективно разделять кофеин от примесей и продуктов деградации. Благодаря простоте выполнения и высокой надёжности метод может быть рекомендован для рутинного контроля качества, исследований стабильности и подтверждения однородности содержания, а также может служить отправной точкой для разработки более экологичных методов.

Список литературы:

1. Bakshi M., & Singh, S. (2002). Development of validated stability-indicating assay methods. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 28(6), 1011-1040.
2. Budavari S. (Ed.). (2001). The Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals (13th ed.). Merck & Co.
3. ICH. (2005). ICH Q2(R1): Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology. International Council for Harmonisation.
4. Moffat A. C., Osselton, M. D., & Widdop, B. (2011). Clarke's Analysis of Drugs and Poisons (4th ed.). Pharmaceutical Press.
5. Ph. Eur. (2021). European Pharmacopoeia (10th ed.). Council of Europe.
6. Snyder L. R., Kirkland, J. J., & Dolan, J. W. (2011). Introduction to Modern Liquid Chromatography (3rd ed.). Wiley.
7. Altabrisa Group. Key ICH method validation parameters to know. Insights, Altabrisa Group; 2025.
8. SIELC Technologies. UV‑Vis spectrum of caffeine. SIELC Technologies; 2026

References:

1. Bakshi, M., & Singh, S. (2002). [Development of validated stability-indicating assay methods]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 28(6), 1011-1040.
2. Budavari, S. (Ed.). (2001). [The Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals (13th ed.)]. Merck & Co.
3. ICH. (2005). [ICH Q2(R1): Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology]. International Council for Harmonisation.
4. Moffat, A. C., Osselton, M. D., & Widdop, B. (2011). [Clarke's Analysis of Drugs and Poisons (4th ed.)]. Pharmaceutical Press.
5. Ph. Eur. (2021). [European Pharmacopoeia (10th ed.)]. Council of Europe.
6. Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Dolan, J. W. (2011). [Introduction to Modern Liquid Chromatography (3rd ed.)]. Wiley.
7. Altabrisa Group. (2025). [Key ICH method validation parameters to know]. Insights, Altabrisa Group.
8. SIELC Technologies. (2026). [UV-Vis spectrum of caffeine]. SIELC Technologies.