Влияние некоторых соединений на агрегацию тромбоцитов в условиях in vitro

АННОТАЦИЯ

Цель: исследование влияния BOS-122, GSC-63, GSC-14 модифицированных сульфатированных полисахаридов на агрегационную активность тромбоцитов в условиях in vitro. Материалы и методы: агрегацию тромбоцитов регистрировали на агрегометре Биола АЛАТ-2 220LA (Россия). В качестве индукторов агрегации тромбоцитов использовали АДФ (2 мкМ), адреналин (5 мкМ) и коллаген и ристомицин (0,5 ед/мл) (Sigma). Результаты: соединение CЦ-GSC-14, так и образец CЦ-BOS-122, вызывали агрегацию тромбоцитов плазмы крови ИБС с увеличением макс. значения (2.73) и макс. наклона (3.04) агрегационной кривой. Однако в отличие от соединения CЦ-BOS-122, CЦ-GSC-14 не вызывал ингибирование АДФ индуцированной агрегации тромбоцитов. Соединения CЦ-BOS-122, CЦ -GSC-63, CЦ-GSC-14 в плазме крови здорового человека не оказывали заметного влияния на коллаген, ристомицин -индуцируемую агрегацию тромбоцитов. Выводы: исследуемые сульфатированные полисахариды обладают антиагрегантными свойствами.

При исследование действия соединений CЦ-BOS-122 , CЦ -GSC-63, CЦ-GSC-14 на агрегацию тромбоцитов в плазме крови здорового человека и ИБС в условиях in vitro, выявлено ингибиторное действие сульфатированных полисахаридов, при котором тромбоциты индуцировались АДФ  и адреналином. Наиболее выраженная ингибирующая активность сульфатированных полисахаридов проявляется при АДФ-индуцируемой агрегации тромбоцитов, видимо вследствие ингибиции циклооксигеназной активности тромбоцитов.

ABSTRACT

Objective: to study the effect of BOS-122, GSC-63, GSC-14 modified sulfated polysaccharides on platelet aggregation activity in vitro. Materials and methods: platelet aggregation was recorded on a Biol ALAT-2 220LA aggregometer (Russia). Platelet aggregation inducers used were ADP (2 μM), adrenaline (5 μM), and collagen and ristomycin (0.5 u / ml) (Sigma). Results: compound CC-GSC-14 and sample CC-BOS-122 caused platelet aggregation of coronary heart disease with an increase in max. values (2.73) and max. slope (3.04) of the aggregation curve. However, unlike the compound CC-BOS-122, CC-GSC-14 did not cause inhibition of ADP-induced platelet aggregation. Compounds CC-BOS-122, CC-GSC-63, CC-GSC-14 in the blood plasma of a healthy person did not significantly affect collagen, ristomycin-induced platelet aggregation. Conclusions: investigated sulfated polysaccharides have antiplatelet properties. When studying the effect of compounds CC-BOS-122, CC-GSC-63, CC-GSC-14 on platelet aggregation in healthy human plasma and coronary heart disease in vitro, the inhibitory effect of sulfated polysaccharides was revealed in which platelets were induced by ADP and adrenaline. The most pronounced inhibitory activity of sulfated polysaccharides is manifested in ADP-induced platelet aggregation, apparently due to inhibition of cyclooxygenase activity of platelets.

Ключевые слова: агрегация, тромбоциты, сульфатированные полисахариды, аденозиндифосфорная кислота, адреналин..

Кeywords: aggregation, platelets, sulfated polysaccharides, adenosine diphosphoric acid, inducers, adrenaline. 

Введение. Основной причиной преждевременной смертности населения во всем мире являются сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ). Ежегодная летальность от ССЗ среди населения Земли в целом составляет 17,7 млн, из которых 7,4 млн смертей приходится на долю ишемическая болезни сердца (ИБС) [1]. Основным фактором риска нарушений деятельности сердечно-сосудистой системы является патологическая активация тромбоцитов, которая приводит к тромбоэмболическим осложнениям [2]. Развитию ишемической болезни сердца предшествуют различные факторы, большое значение в патогенезе коронарной недостаточности при ИБС имеют нарушения функции тромбоцитов и повышение свертываемости крови, что может ухудшать микроциркуляцию в капиллярах миокарда и приводить к тромбозу артерий, которому способствуют атеросклеротические изменения их стенок и замедление кровотока в местах сужения просвета артерий.

Углеводные биополимеры, составляющие группу некрахмальных полисахаридов, характеризуются широким спектром фармакологических эффектов, низкой токсичностью и высокой степенью безопасности [3]. К таким соединениям относятся пектины, альгинаты, фукоиданы, каррагинаны, хитозаны. Рядом авторов показано, что фукоидан повышает агрегацию тромбоцитов in vitro [4,5], другие авторы указывают на выраженный антиагрегантный эффект. Сульфатированный полисахарид  PF2 также проявлял слабое влияние на антитромбин-зависимый тромбин или ингибирование фактора Ха [6]. В обзоре [7] собрана корелляция между структурой антикоагулянтной, антитромбической и геморрагической (способность вызывать кровотечения) активностью гепарина, сульфата гепарина, низкомолекулярных гепаринов и гепариноподобных соединений из различных источников. В связи с этим изучение механизмов действия сульфатированных полисахаридов на активацию тромбоцитов и их агрегационную активность, а также коррекция патологии с помощью этих соединений  являются актуальной проблемой в  медицине.

Цель исследования. Изучение влияние линейных модифицированных сульфатированных полисахаридов CЦ-BOS-122, CЦ -GSC-63, CЦ-GSC-14, с различной молекулярной массой (рис.1.) на коагуляцию плазмы, которые в разной степени удлиняют АВРП (время рекальцификации плазмы), АЧТВ, тромбиновое время и протромбиновое время.

Рисунок 1. Общая структурная формула сульфатированных полисахаридов

Полученные результаты показали, что исследованные соединения относятся к антикоагулянтам прямого действия.  Соединения активируя антитромбин III необратимо угнетают IXa, Xa, XIa и XIIa факторы свертывающей системы, нарушая при этом образование  тромба и инактивируя тромбин, умеренно снижают агрегацию тромбоцитов. Механизм действия АК прямого действия связан либо с непосредственным ингибированием активности тромбина или фактора Ха, либо с активацией их плазменного ингибитора антитромбина [8]. [Choay J., 1983; Vo Т., 2014].

Действия антикоагулянтов на агрегацию тромбоцитов неоднозначно. Например, гепарин с одной стороны, инактивируя тромбин, он может уменьшать или предупреждать агрегацию тромбоцитов. С другой стороны, гепарин способен усиливать агрегацию тромбоцитов, вызванную другими индукторами (помимо тромбина), причем это его свойство в определенной мере зависит от молекулярной массы. Это обусловлено тем, что высокомолекулярные фракции гепарина имеют два активных центра: один - для связывания с антитромбином III, другой-реагирующий с мембраной тромбоцитов, в то время как низкомолекулярные его фракции обладают только одним центром связывания, аффинным к антитромбину III.

Для оценки антиагрегантных свойств соединений используются разные индукторы агрегации тромбоцитов. Известно, что индукторы агрегации тромбоцитов обладают различными механизмами активации тромбоцитов, действуя на клеточные факторы, которые совершают ряд последовательных и взаимообусловленных превращений - адгезию и агрегации тромбоцитов. АДФ, адреналин, коллаген, ристомицин и арахидоновая кислота являются наиболее используемыми индукторами для исследования функциональной активности тромбоцитов.

Материалы и методы. Для определения агрегации тромбоцитов исследования проводили на богатой плазме крови здорового человека и ИБС. Тромбоциты выделяли методом центрифугирования при 1150 об/мин, в течение 5 мин., для осаждения эритроцитов. Плазму, обогащенную тромбоцитами, повторно центрифугировали в течение 10 мин. при 3 тыс. об/мин. Осадок тромбоцитов суспендировали в 5 мл среды, содержащей 150 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 0,37 мМ NaH₂PO₄, 1 мМ MgCl₂, 1 мм CaCl₂, 5 мМ глюкозу, 10 мМ HEPES-NaOH, pH 6,55, 50 ед/мл гепарина, 0,35% сывороточного альбумина и 0,15 мг/мл апиразы. Все операции проводили в пластиковой посуде при комнатной температуре. В работе использовали наиболее эффективные образцы сульфатированных полисахаридов CЦ-BOS-122, CЦ -GSC-63, CЦ-GSC-14.

Агрегация тромбоцитов регистрировалась по методу Борна на агрегометре Биола АЛАТ-2 220LA (Россия). В качестве индукторов агрегации тромбоцитов использовали АДФ (2 мкМ), адреналин (5 мкМ) и коллаген и ристомицин (0,5 ед/мл) (Sigma). Процесс образования агрегатов визуализировали графически. Степень агрегации тромбоцитов выражали в % от максимального уровня светопропускания (Т%, макс).

Результаты. В предварительных экспериментах оценивали влияние сульфатированных полисахаридов на агрегацию тромбоцитов и коагуляцию плазмы. Хотя известно, как влияют вышеперечисленные индукторы на функцию тромбоцитов, в исследованиях при оценке их агрегационной активности следует устанавливать свои реверсивные значения в зависимости от аппарата и реагентов.

В связи с этим, нами было изучено влияние агонистов: АДФ, адреналина, коллагена и ристомицина на функциональную активность тромбоцитов в плазме крови здорового человека и ИБС в условиях in vitro.

При исследовании плазмы крови здорового человека не наблюдалась спонтанная агрегация тромбоцитов. Степень агрегации при добавлении индуктора АДФ в плазму крови здорового человека, в зависимости от концентрации (1-5- мкг/мл) наблюдалась первичная однофазная и вторичная агрегация в виде двухфазной кривой, при высоких концентрациях (10 мкг/мл), необратимая агрегация тромбоцитов (рис.2 а)

Другой индуктор -адреналин в концентрациях 1-10 мкг/мл, также как АДФ, дозазависимо индуцировал агрегацию тромбоцитов. Адреналин в концентрации 1мкг/мл вызывал агрегацию в виде двухфазной кривой, а при более высоких концентрациях вызывал необратимую агрегацию тромбоцитов, что соответствует литературным данным (рис. 2б)

Рисунок 2 (А) АДФ-индуцируемая агрегация тромбоцитов плазмы крови здорового человека:

в концентрациях 1- 1мкг/мл; 2- 5мкг/мл; и 3- 10 мкг/мл. (Б) Адреналин-индуцируемая агрегация тромбоцитов плазмы крови здорового человека: в концентрациях 1- 1мкг/мл; 2-5мкг/мл.

В случае с плазмой крови больных ИБС (агрегационную активность тромбоцитов плазмы крови больного оценивали при поступлении пациентов в стационар), наблюдалась спонтанная агрегация тромбоцитов.

При индуцировании с АДФ (1 мкг/мл) наблюдалась как вторичная агрегация, так в концентрациях 5-10 мкг/мл наблюдалась необратимая агрегация тромбоцитов. При индуцировании с адреналином также, в низких концентрациях 1-5 мкг/мл адреналин вызывал необратимую агрегацию тромбоцитов.  Как известно, действие АДФ опосредуется через связывание с рецептором P2Y12, играющий важнейшую роль в активации тромбоцитов, включая агрегацию, секрецию, высвобождение факторов коагуляции. Адреналин отображает ТХА2-зависимый путь активации кровяных пластинок.

Полученные результаты свидетельствуют об активации рецептора P2Y12 и ТХА2-зависимого пути активации тромбоцитов плазмы больных ИБС в сравнение с контролем [9]. В следующей серии исследованы действия коллагена и ристомицина на агрегационную активность тромбоцитов в плазме крови здорового человека и ИБС. Как известно, ристомицин -индуцированная агрегация
тромбоцитов косвенно характеризует активность фактора Виллебранда. Коллаген-индуцированная агрегация характеризует целостность эндотелиального слоя .

В отличие от АДФ и адреналин-индуцированной агрегации, при коллаген и ристомицин-индуцированной агрегации, в плазме крови здорового человека и при ИБС, наблюдалась почти одинаковая однофазная, необратимая кривая, что показывает при ИБС существенно не меняется коллаген и ристомицин-индуцированная агрегация тромбоцитов.

При исследование действия соединений CЦ-BOS-122 , CЦ -GSC-63, CЦ-GSC-14 на агрегацию тромбоцитов в плазме крови здорового человека и ИБС в условиях in vitro, выявлено ингибиторное действие сульфатированных полисахаридов, при котором тромбоциты индуцировались  АДФ  и адреналином (рис 3.).

Рисунок 3. Влияние CЦ-BOS-122, CЦ-GSC-63, CЦ-GSC-14 на агрегацию тромбоцитов в плазме крови здорового человека и ИБС:

1. АДФ-индуцируемая агрегация; 2. Адреналин-индуцруемая агрегация; 3. ристомицин- индуцируемая агрегация; 4. Коллаген- индуцируемая агрегация тромбоцитов

Исследуемые соединения CЦ-BOS-122, CЦ -GSC-63, CЦ-GSC-14 в плазме крови здорового человека не оказывали заметного влияния на коллаген, ристомицин -индуцируемую агрегацию тромбоцитов. В случаях с плазмой (ИБС больных) наблюдалось стимулированная коллаген, ристомицин –индуцируемая агрегация тромбоцитов.

Обсуждение.

Полученные результаты показали, что наиболее выраженная ингибирующая активность сульфатированных полисахаридов проявляется при АДФ-индуцируемой агрегации тромбоцитов, видимо вследствие ингибиции циклооксигеназной активности тромбоцитов.  В эксперименте, когда тромбоциты были индуцированы с АДФ (1мкг/мл) наблюдалась вторичная агрегация с макс. значением (20.99) и макс. наклоном (56.1) в плазме крови ИБС (рис.4а). Соединение CЦ-BOS-122 в концентрации 10 мкг/мкл, также вызывало агрегацию тромбоцитов  с увеличением макс. значения  (10.54) и макс. наклона (9.025) агрегационной кривой (рис4а). Однако соединение CЦ-BOS-122 в концентрации 10 мкг/ мкл ингибировал АДФ индуцированную агрегацию тромбоцитов на 50% и снижал макс. значение (8.09), макс. наклон (3.95) агрегационной кривой (рис.4б).

Рисунок 4. Влияние CЦ-BOS-122 на АДФ-индуцируемую агрегацию тромбоцитов при ИБС

А - Влияние CЦ-BOS-122 (10мкг/мл) и АДФ (1мкг/мл) на агрегацию тромбоцитов. Б- Влияние CЦ-BOS-122  на АДФ-индуцируемую агрегацию тромбоцитов.

Соединение CЦ-GSC-14, так и образец CЦ-BOS-122, также вызывал агрегацию тромбоцитов плазмы крови ИБС с увеличением макс. значения (2.73) и макс. наклона (3.04) агрегационной кривой. Однако в отличие от соединения CЦ-BOS-122, CЦ-GSC-14 не вызывал ингибирование АДФ индуцированной агрегации тромбоцитов (рис.5а).

Соединение образца CЦ -GSC-63 в отличие от соединения CЦ-GSC-14, CЦ-BOS-122 не влияло на агрегационную активность тромбоцитов, но ингибировало АДФ индуцированную агрегацию тромбоцитов и имели минимальные значения показателя агрегации  (20.99) и наклона (56.1). (рис.4а) При индуцировании с АДФ (1 мкг/мл) наблюдалась вторичная агрегация с макс. значением (20.99) и макс. наклоном (56.1). При добавлении 10 мкг/мкл соединения CЦ-BOS-122 к плазме крови, АДФ-индуцируемая агрегация тромбоцитов ингибируется  на 65% и составляет  макс. значение (8.09), макс. наклон (3.95). (рис. 5б).  

Рисунок 5. Влияние CЦ-GSC-14 и CЦ -GSC-63  на АДФ-индуцируемую агрегацию тромбоцитов ИБС

А - Влияние CЦ-GSC-14(10мкг/мл)  и CЦ -GSC-63  (10мкг/мл)  на агрегацию тромбоцитов. Б- Влияние CЦ-GSC-14 и CЦ -GSC-63 на АДФ-индуцируемую агрегацию тромбоцитов

Если учесть, что АДФ связывается со своим рецептором на поверхности тромбоцитов, связывание АДФ с рецептором P2Y1 вызывает изменение формы и инициирует агрегацию тромбоцитов (первичную волну) за счет мобилизации кальция. Рецептор P2Y12 считается основным АДФ-рецептором и ответственным за полную агрегацию тромбоцитов через ингибирование аденилатциклазы. При этом ключевым звеном активации тромбоцитов является мобилизация ионов кальция из внутриклеточных депо.

Эти данные могут свидетельствовать о том, что исследуемые вещества в наибольшей степени влияют на активность гликопротеиновых рецепторов на мембране тромбоцитов и представляют определенный интерес и требуют дальнейшего детального изучения физико-химических характеристик и механизмов их действия, что в конечном итоге позволит использовать их в качестве гепариноподобного препарата.

Выводы

1. Установлено сравнительное действие индукторов АДФ, адреналина, коллагена и ристомицина на функциональную активность тромбоцитов в плазме крови здорового человека и ИБС в условиях in vitro, которое  происходит за счет активации рецептора P2Y12 и ТХА2-зависимого пути при ИБС.

2. Показано влияние сульфатированных полисахаридов CЦ-BOS-122, CЦ -GSC-63, CЦ-GSC-14 на АДФ, адреналин- индуцируемую агрегацию тромбоцитов, опосредованную их действием на активность гликопротеиновых рецепторов на мембране тромбоцитов.

3. Соединение образца CЦ -GSC-63 в отличие от соединения CЦ-GSC-14, CЦ-BOS-122 не влияло на агрегационную активность тромбоцитов, но ингибировало АДФ индуцированную агрегацию тромбоцитов

Список литературы:
1. World Health Organization. Cardiovascular Diseases Fact Sheet. URL: (date of access May 2017).
2. (Weyrich, Zimmerman, 2004; Gawaz et al. 2005).
3. de Andrade Moura et al., 2001; Mayer, Hamman, 2004; Mousa, 2010; Vilahur, Badimon, 2013. Antitromotic effects of naturalally derived products on coagulation and platelet function // Methods Mol. Biol. 2010. V. 663. P.229-240.
4. de Azevedo T.C.,G., Bezerra M.E.B., Santos M.G.L. et al. Heparinoids algal and their anticoagulant hemorragic activities and platelet aggregation // Biomedicine & Pharmacotherapy. 2009. V. 63, N. 7. P. 477-483.
5. Deacon-Smith et al., 1985; Zhu et al., 2010). Deacon-Smith R.A., Lee-Potter J.P., Rogers D.J. Platelet aggregation in the presence of extracts of British marine algae // Med. Lab. Sei. 1985. V. 42. P. 404-405.
6. Na Li 1, Xue Liu 2, Xiaoxi He 2. Structure and Anticoagulant Property of a Sulfated Polysaccharide Isolated From the Green Seaweed Monostroma Angicava 2017. V.159. N.1. P.195-206
7. H. B. Nader, C. C. Lopes, H. A. Rocha, and E. A Santos, Curr. Pharm. Des., 10(9), 951 – 966 (2004).
8. Choay J., 1983; Vo Т., 2014.
9. Armstrong PC, Leadbeater PD, Chan MV, Kirkby NS, Jakubowski JA, Mitchell JA, Warner TD. In the presence of strong P2Y12 receptor blockade, aspirin provides little additional inhibition of platelet aggregation. J Thromb Haemost 2011; 9: 55.