Синтез наночастиц в матрице карбоксиметилхитозана Bombyx mori методом осадительной коацервации

АННОТАЦИЯ

Для формирования наночастиц методом осадительной коацервации, использован водорастворимый N-карбоксиметилхитозан, полученный на основе национального сырья, куколок тутового шелкопряда Bombyx mori. С помощью метода атомно-силовой микроскопииопределена сферическая форма и размер наночастиц от 5 до 116 нм в зависимости от условий процесса.Изменение размера образованных наночастицкарбоксиметилхитозана объяснено термодинамическим качеством растворителя и концентрацией звеньев КМХЗ участвующих в парном столкновении.

ABSTRACT

For the formation of nanoparticles by sedimentary coacervation, a water-soluble N-carboxymethylchitosan is used, obtained on the basis of national raw materials, Bombyxmori silkworm pupae. The spherical shape and size of nanoparticles is from 5 to 116 nm, depending on the process conditions. A change in the size of the formed carboxymethylchitosan nanoparticles explains the thermodynamic quality of the solvent and the concentration of CMChZ units involved in the pair collision.

Ключевые слова: N-карбоксиметилхитозан, наночастицы, осадительная коацервация.

Keywords: N-carboxymethylchitosan, nanoparticles, precipitation coacervation.

Интерес к наноразмерным частицам (НРЧ) различных веществ, связан с их высокой химической активностью и возникновением необычных поверхностных явлений и реакций. Как следствие, частицы размером порядка 1 нм практически безактивационно вступают в реакции с другими химическими соединениями, в результате которых получаются вещества с новыми свойствами, а сами процессы характеризуются принципиально новыми кинетическими и термодинамическими свойствами и закономерностями. Научное осмысление и практическая реализация наноразмерных эффектов и подходов является основой для появления нового направления в науке и технологии [1].К настоящему времени одним из наиболее известных методов формирования наночастиц (НЧ) является осадительная коацервация, основанная на получении НЧ без использования токсичных сшивающих агентов, что особенно важно при дальнейшем использовании полимерных препаратов для медицинских целей. Для этого могут быть использованы как синтетические, так и природные полимеры, в частности, хитозан (ХЗ) и его водорастворимые производные. Актуальность исследований, связанных с изучением свойств хитозана, подтверждается тем, что на основе данного полимера можно синтезировать водорастворимые производные, в частности –карбоксиметилхитозаны (КМХЗ), которые представляют интерес при использовании их в медицине [2]. Для получения природных полимеров, необходим постоянный источник сырья, в частности для Узбекистана таковыми являются куколки тутового шелкопряда Bombyx mori. Количество отходов шелковой промышленности составляет 70-80%, что создает устойчивую базу для развития и создания в стране препаратов на основе на их основе [3].

В связи с вышесказанным, цель настоящей работы состоит в исследовании процесса образования наночастиц карбоксиметилхитозана методом осадительной коацервации. К числу преимуществ осадительной коацервации следует отнести, то что, полученные частицы не обладают токсичностью и легко выводятся из организма, не вызывая побочных реакций.

Материал и методы исследования.

Для синтеза N- КМХЗ (B.m.) использовали хитозан, полученный на основе куколок тутового шелкопряда со следующими характеристиками: молекулярная масса (ММ) - 6.5×10⁴; степень деацетилирования (ДА) - 85%; глиоксиловая кислота (ГК) - Mumbai-400086, IndiaCustomerCareNo:022-6116 9797; бидистиллят – 18 МОм×см^-1; боргидрид натрия (NaBH₄), уксусная кислота (CH₃COOН), спирт этиловый (С₂Н₅ОН) [4].

Вискозиметрия. Для определения молекулярной массы исходного хитозана и N-КМХЗ использовали метод вискозиметрии. Характеристическую вязкость [η] определяли с использованием вискозиметра Уббелоде при 25°С. Для подавления  полиэлектролитного эффекта в случае ХЗ применяли раствор 2% уксуснокислого натрия (CH₃COONa), а для N-КМХЗ использовали - 2 % раствор хлорида натрия. Молекулярные массы (Мη) образцов ХЗ рассчитывали по уравнению Марка-Куна-Хаувинка [5].

Кондуктометрическое титрование. Степень замещения N-КМХЗ определяли с помощью кондуктометрического титрования на приборе EC 214. Для осуществления кондуктометрии приготовлены растворы ХЗ и N-КМХЗ 1 г/л в 0,1N растворе НСI. Полученные растворы полимеров оттитровывали 0,5н. раствором NaOH. При этом контролировали изменения электропроводимости (G_sm) в зависимости от объема (V), добавленного титранта [6].

ЯМР спектроскопия. Спектры ЯМР ¹³С и ¹H регистрировали на приборе VARIAN 400 USA относительно сигналов растворителя при комнатной температуре. В качестве растворителя использовали D₂O/DCl [7].

Определена величина внутренней энергии при малых значениях числа частиц в единице объема, которая может быть разложена в степенном ряде в виде:

U=VkT(n2B+n3C+…)

где V-объем системы, а В и С – коэффициенты разложения, называемые вириальными коэффициентами (В – второй вириальный коэффициент, С – третий и т.д.).

При высоких температурах в потенциале взаимодействия звеньев доминирует отталкивание, а при низких - притяжение. Это означает, что при высоких температурах внутренняя энергия клубка U, а с нею и второй вириальный коэффициент В положительны, а величины U и В должны быть отрицательны, так как наиболее важна притягивательная часть, где функция потенциала взаимодействия меньше нуля.

Результаты и обсуждение.

Для формирования НЧ использовали N- КМХЗ (B.m.), к которому был добавлен осадитель в виде хлорида кальция (СаСl₂), концентрация раствора которого составляла 0,95%  в количестве 50 мкл.Структурные исследования проводили атомно-силовой микроскопией (сканирующий зондовый микроскоп Agilent 5500). В работе применялись кремниевые кантилеверы жесткостью 9,5 Н/м² с частотой 145 кГц. Максимальная область сканирования на АСМ по координатам Х-У составляет-2.5х2.5 мкм², по Z-1 мкм. Изучены кинетические закономерности образования наночастиц карбоксиметилированного хитозана с концентрацией С=0,67% в зависимости от времени истечения раствора осадителя (1 -20 мин) хлорида СаСI₂ (С=1%). Полученные данные представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Зависимость размера наночастиц КМХЗ с концентрацией С=0,67% от времени истечения осадителя

Выявлено, что с увеличением времени истечения осадителя -хлорида кальция наблюдается увеличение размера наночастиц от 200 нм до 1 мкм. Однако при дальнейшем увеличении времени истечения СаСI₂ в течение 15 мин размер наночастиц составил 88 нм, что является оптимальным временем для данного раствора КМХЗ с концентрацией С=0,67%, поскольку далее (в течение 20 мин) также наблюдается увеличение размера НЧ и составляет значение 430 нм.

Проведено изучение зависимости размера НЧ от времени истечения раствора полимера при концентрации С_КМХЗ =1,0%.

Таблица 2.

Зависимость размера наночастиц КМХЗ при концентрациираствора С=1,0%

Согласно полученным данным таблицы 2 выявлено, что при увеличении концентрации раствора полимера от 0,67% до 1,0% наблюдается увеличение размера наночастиц. При этом, более оптимальным, в данных условиях является 10 минутное время истечения осадителя, при котором размер частиц составляет 116 нм, они имеют вид сферической формы. Такое явление весьма оправдано и связано с природой молекулы карбоксиметилхитозана.

Проведено изучение молекулярной массы КМХЗ на размер частиц данные приведены в таблице 3.

Таблица 3.

Зависимость размера наночастиц КМХЗ от молекулярной массы

В результате проведенных исследований выявлено, что размер наночастиц зависит от молекулярной массы макромолекулярной цепи. При низких концентрациях раствора полимера ~0,5% и малой молекулярной массы N-КМХЗ B.m. ~22 000 образуются наночастицы размерами ~5 нм. Это обусловлено, тем, что происходят конформационные изменения и увеличение плотности зарядов в макромолекулярной цепи при связывании КМХЗ с ионами кальция.

Выводы

Таким образом, формирование НЧ карбоксиметилхитозана можно обяъснить, тем, что, вероятно, наночастицы состоят из микродоменов комплексов КМХЗ/хлорид кальция, окруженных матрицей карбоксиметилхитозана. На основе полученных экспериментальных данных выявлено, что с увеличением концентрации растворов КМХЗ размер наночастиц увеличивается, что может быть, объяснено термодинамическими свойствами растворителя и концентрацией звеньев КМХЗ участвующих в парном столкновении. Одним из важных термодинамических параметров, определяющих свойства полимерных растворов, является параметр χ, характеризующий изменение энергии Гиббса растворителя, при введении в него некоторого количества осадителя. Особенности термодинамического поведения растворов полимеров обусловлены тем, что макромолекулу можно расположить в растворителе большим числом способов, так как она может принимать огромное число различных конформаций. При наличии взаимодействия звеньев свободная энергия полимерного клубка включает не только энтропийное слагаемое, но и слагаемое внутренней энергии взаимодействия звеньев, ответственное за набухание клубков с исключенным объемом.

Список литературы:
1. Yang J., Han S., Zheng H., Dongand H. Liu J. Preparation and application of micro/nanoparticles based on natural polysaccharides // Carbohydrate Polymers.-2015. -Vol. 123, -P. 53–66,
2. Zhiyan Yu, Xin Sun, Haixia Song, Wenqian Wang, Zhao Ye, Liyan Shi, Kaikai Ding. Glutathione-Responsive Carboxymethyl Chitosan Nanoparticles for Controlled Release of Herbicides // Materials Sciences and Applications. -2015, -Vol. 6. -Р. 591-604
3. Милушева Р.Ю., Рашидова С.Ш. // Хитин, хитозан Bombyx mori и наносистемы на их основе. – Ташкент.: Фан, 2016. -С.5-16.
4. Кличева О.Б., Алиев Х.У., Батырбеков А.А., Рашидова С.Ш. Синтез N-карбоксиметилхитозана Bombyx mori и его роль в оценке гематологических показателей // Химия природных соединений.- 2017. –Вып.4. –С. 619-620.
5. Kalliola S., Repo E., Srivastava V., Heiskanen J.P., Sirviö J.A., Liimatainen H., Sillanpää M. The pH sensitive properties of carboxymethyl chitosan anoparticles cross-linked with calcium ions // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. -2016, V.153 -P. 229-236
6. Doshi B, Repoa E., Heiskanenb J.P., Sirviöc J.A., Sillanpää M. Effectiveness of N,O-carboxymethyl chitosan on destabilization of Marine Diesel, Diesel and Marine-2T oil for oil spill treatment //Carbohydrate Polymers. -2017, -Vol. 167 -Р. 326-336
7. Bukzem A.L., Signini R., Santos dos D.M., Lião L.M., Ascheri D.P.R. Optimization of carboxymethyl chitosan synthesis using response surface methodology and desirability function // International Journal of Biological Macromolecules. -2016, -Vol. 85 -Р. 615-624