Изучение специфических липолитических ферментов желудка крыс

АННОТАЦИЯ

Проведен олигонуклеотид микрочип анализ высокоочищенных париетальных и энтерохромаффин- подобных клеток желудка крысы. Поиск и анализ маркерных генов для различных эпителиальных клеток желудка показал достоверность полученных результатов. Из 41000 транскриптов нами обнаружены 84 гены для различных липолитических ферментов, которые экспрессируются в эпителиях желудка. Нами обнаружено, что 7 из этих генов значительно обогащены мРНК в париетальных клетках. Специфичность липолитических ферментов для париетальных клеток подтверждены методом ПЦР в реальном времени.

ABSTRACT

It was conducted the oligonucleotide microarray analyses of the highly purified parietal and enterochromaffin-like cells from rat stomach. Search and analysis of marker genes for the stomach epithelial cells was confirmed of the accuracy of the results. Of 41,000 transcripts we found 84 genes for lipolytic enzymes that are expressed in the gastric epithelia. We found that mRNAs of 7 genes of lipolytic enzymes were greatly enriched in purified parietal cells. Specificity of lipolytic enzymes for parietal cells was confirmed by Real-time PCR analysis.

Ключевые слова: транскриптомика, олигонуклеотидный микрочип анализ, париетальные (PC) и энтерохромафин-подобные (ECL) клетки, ферменты.

Keywords: transcriptomics, oligonucleotide microarray analysis, parietal (PC) and entero-chromaffin-like (ECL) cells, enzymes.

Введение

Транскриптомика - это набор инструментов и подходов для глобального анализа экспрес­сии генов, то есть транскриптомы. Задачей транскриптомики является определение, описа­ние механизмов регуляции экспрессии генов [1]. Технологии полногеномной транскрипто­мики могут быть подразделены на 2 группы [1,2]: анализ на основе микрочипов, созданных на основе уже известных последовательностей и сиквенсный подход, делающий возмож­ным транскриптомный анализ, не требующий предположений относительно экспрессирую­щихся локусов. Важное место среди сиквенс-подходов занимает сегодня RNA-Seq.

Идентификация новых специфических генов в эпителиальных клетках желудочно- кишечного тракта методами транскриптомики приведёт к новым методам лечения забо­леваний желудочно-кишечного тракта [3,4]. Несмотря на то, что накоплено много экспери­ментальных данных о функциях некоторых распространённых белков, экспрессированных в основных типах эпителиальных клеток слизистой оболочки желудка, другие белки все еще не идентифицированы. Среди них мало изученные липо- литические ферменты, класс ферментов которые превращают липидные молекулы [5]. Липазы расщепляют раститель­ные масла и животные жиры в организме и применяются в производстве биотопливо [6].

Фосфолипазы участвуют в передаче сигнала внутри клетки, также используются при синте­зе производных фосфолипидов для пищевой промышленности и медицины. К настоящему времени ферменты метаболизма сфингомиелина подробно не изучены [7].

Материалы и методы

Высокоочищенные париетальные и ECL клетки из желудка крысы были получены мето­дами центрифугирования в и сортировкой клеток, основанного на флуоресценции [8,9]. В случае париетальных клеток при сортировке использовали автофлуоресценцию самых кле­ток в присутствии 10 мМ раствора глюкозы. До сортировки ECL клеток в суспензию клеток добавляли 100 нмол краситель – акридиновый оранж. Чистоту выделенных клеток оце­нивали с помощью конфокальной микроскопии и иммуноокрашивания с использованием антител против альфа субъединицы НК-АТФазы и гистидин-карбоксилазы.

Общую РНК из эпителия желудка (St) и высокоочищенных клеток выделяли с использо­ванием набора NucleoSpin RNA II Kit (BD Bioscicences). Чистоту и стабильность РНК определя­ли в Bioanalyser 2100 (Agilent Technologies).

Олигонуклеотид-микрочип анализ проводили в лаборатории G.Sachs (UCLA) согласно протоколу фирмы Agilent Technologies с трехкратным повтором. Количественный ПЦР ана­лиз в реальном времени проводили в приборе FAST с помощью набора Dynamo SYBR Green qPCR Kit (Finnzymes). Метод олигонуклеотид-микрочипов позволил нам получить подроб­ный профиль экспрессии генов специфических типов клеток мукозы желудка крыс.

В работе были использованы специфические праймер пары для клеточных маркеров, и липолитических ферментов.

Результаты и обсуждение

Ранее Якубов И.Т. совместно c учеными Калифорнийского университета проводил олигонуклеотид микрочип анализ экспрессии генов высокоочищенных париетальных и энтерохромаффин-подобных клеток желудка крысы [10]. Этот метод анализа был назван «вычитающиеся гибридизацией» и позволил идентифицировать специфические гены для париетальных и энтерохромаффин-подобных клеток эпителия желудка. Профили экспрес­сии генов предлагают белки, участвующие в новых функциях в обоих типах клеток, которые могут быть дополнительно изучены с помощью классических физиологических модельных систем.

На основании базы данных профилей ген экспрессии париетальной, энтерохромаффин- подобной и общей желудочной клеток нами проведены поиск и скрининг следующих ли­политических ферментов: липаз, фосфолипаз и сфингомиелин-связанных ферментов. Значения интенсивности экспрессии генов в микрочипах были усреднены и определены со­отношения интенсивности очищенных клеток к общим клеткам желудка крысы.

Нами обнаружены 84 различных липолитических ферментов, которые экспрессируют­ся в эпителиях желудка, для 7 из них значительно обогащены мРНК в париетальных клет­ках (таблица). Нами обнаружены высокие уровни экспрессии липолитических ферментов в очищенных париетальных клетках по сравнению с эпителием желудка.

Таблица 1.

Экспрессия липолитических ферментов специфических для париетальных клеток

Из таблицы видно, что соотношение мРНК в париетальных клетках к мРНК общей клетки желудка для фосфолипазы С подобной (Plcl1), фосфатидилсерин специфическая  фосфоли­паза А1 (Pspla1), гликозилфосфатидилинозитол фосфолипаза Д (Gpld1), лизофосфолипаза 1 (Lypla1), липопротеин липаза (Lpl), кислая сфингомиелиназа-подобная фосфодиэстераза 3A (Smpdl3a) сфингомиелин синтаза 2 (Sms2) составляли в пределах 1.55 – 3.85.

С использованием базы данных Национального Института Биотехнологической Инфор­мации (Pubmed) [11] были определены нуклеотидные последовательности генов, предпо­лагаемые аминокислотные последовательности, домены и предполагаемые функции семи вышеуказанных липолитических ферментов. Сравнение нуклеотидных последовательно­стей генов фосфолипаз среди млекопитающих показало некоторые различия между вида­ми. На основании проведенных анализов можно предположить, что 5 генов ферментов из 7 представляет наибольшей интерес для функционирования париетальных клеток. Фосфо­липаза С-подобной 1 является инозитол 1,4,5-трифосфат связывающим белком с молеку­лярной массой 130 кДа не обладающей каталитической активностью. ФС-специфическая фосфолипаза А1 и GPI фосфолипаза Д, по-видимому, участвует в передачи сигнала внутри клетки, а также в перемоделировании внутриклеточных мембранных систем париеталь­ных клеток. Сфингомиелин синтаза 2

[11] катализирует ферментативный синтез молекул сфингомиелина из молекулы фосфа­тидилхолина, как мы предполагаем приводить к изменению свойств апикальной мембра­ны париетальной клетки при секреции желудочной кислоты.

Кроме того, количественный анализ транскриптов вышеуказанных липолитических фер­ментов с помощью ПЦР в реальном времени показал увеличение содержание мРНК этих ферментов в очищенных париетальных клетках.

Заключение

Таким образом, поиск и анализ транскриптов в очищенных париетальных клетках на олигонуклеотид микрочипах показали высокую и специфическую экспрессию мРНК для ли­паз, фосфолипаз и сфингомиелин-связанных ферментов. Анализ экспрессии генов липоли­тических ферментов с помощью метода ПЦР в реальном времени подтвердили получен­ные результаты методом олигонуклеотид микрочип анализа. Дальнейшие исследования с помощью современных методов анализа, таких как двумерный электрофорез с масс- спектрометрией, флуоресцентная микроскопия и другие позволяют нам более детально по­нимать клеточную биологию париетальной клетки и принципы секреции кислоты в желудке.

Список литературы:
1. Wang Z., Gerstein M., Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 2009; Vol. 10, № 1: 57-63.
2. Calvel P., Rolland A.D., Jégou B., Pineau C. Testicular postgenomics: targeting the regulation of sper¬matogenesis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2010; Vol. 365, № 1546:1481-1500.
3. Lambrecht N.W., Yakubov I., Scott D., Sachs G. Identification of the K efflux channel coupled to the gastric H,K-ATPase during acid secretion. Physiological Genomics, 2005;Vol.21:81-91.
4. Resnick MB, Sabo E, Meitner PA, Kim SS, Cho Y, Kim HK, Tavares R, Moss SF. Global analysis of the human gastric epithelial transcriptome altered by Helicobacter pylori eradication in vivo. Gut. 2006; Vol.55, № 12:1717-1724.
5. Borrelli G.M., Trono D. Recombinant Lipases and Phospholipases and Their Use as Biocatalysts for Industrial Applications. Int J Mol Sci. 2015; Vol.16, No 9:20774-20840.
6. Cesarini S., Haller R.F., Diaz P., Nielsen P.M. Combining phospholipases and a liquid lipase for one-step biodiesel production using crude oils. Biotechnol Biofuels. 2014; Vol.7, № 1:1-12.
7. Masayuki Sugimoto, Yoichi Shimizu, Songji Zhao, Naoyuki Ukon, Ken-ichi Nishijima, Masato Wak¬abayashi, Takeshi Yoshioka, Kenichi Higashino, Yoshito Numata, Tomohiko Okuda, Nagara Tamaki, Hisa¬toshi Hanamatsu, Yasuyuki Igarashi, Yuji Kuge. Characterization of the role of sphingomyelin synthase 2 in glucose metabolism in whole-body and peripheral tissues in mice. Biochimica et Biophysica Acta 2016;Vol.1861:688–702.
8. Lambrecht N.W., Yakubov I., Zer C., Sachs G. Transcriptomes of purified gastric ECL and parietal cells: identification of a novel pathway regulating acid secretion.//Physiological Genomics, 2006; Vol.25, №1:153-165.
9. Lambrecht N.W., Yakubov I., Sachs G. Fasting-induced in ECL cell gene expression.// Physiol. Genom¬ics, 2007; Vol.31:183-192.
10. Sachs G., Shin J.M, Vagin O., Lambrecht N.W., Yakubov I., Munson K. The gastric H,K ATPase as a drug target: past, present, and future. J Clin Gastroenterol. 2007; Vol.41: 226-242.
11. NCBI (электронный ресурс): ncbi.nlm.nih.gov