Изучение антиоксидантных свойств некоторых полифенолов на процесс ПОЛ в мембранах митохондрий

АННОТАЦИЯ

В данной статье изучена антиоксидантная активность некоторых полифенольных соединений ПОЛ митохондрий печени крыс. Установлено, что фенольные соединения:  рутин, эуфорбин и мегосин оказывают протекторное действие на митохондрии, уменьшая повреждающее действие Fe²⁺/аскорбат.

ABSTRACT

In this article concentration and structure-activity relationship of antioxidant activity of phenolic compounds, as well as their effect on lipid peroxidation on rat liver mitochondria was investigated. It was established that all phenol compounds׃ rutin, euphorbin and megosinium inhibite nonfermentative Fe²⁺/ ascorbate-dependent peroxide oxidation of mitochondrial membrane lipids.

Ключевые слова: антиоксиданты, Fe²⁺/аскорбат, полифенольные соединения, митохондрий, ПОЛ.

Keywords: antioxidant, Fe²⁺/ ascorbate, polyphenolic compounds, mitochondria, lipid per oxidation.

Введение. Многие распространенные болезни и осложнения связаны с дефицитом в организме человека эндогенных антиоксидантных  веществ [Harman, 2006; Анисимов, 2008].  Дисбаланс показателей антиоксидантной и прооксидантной систем, приводит к нарушению регуляций клеточного гомеостаза [ Хавинсон и соавт., 2003; Дубинина, 2006].

Одним  из важнейших  компонентов нарушения антиоксидантных  систем организма является активация перекисного окисления липидов (ПОЛ). Известно, что антиоксидантные препараты регулируют процессы ПОЛ создавая оптимальные условия для нормального метаболизма и функционирования клеток и тканей.

Известно, что  растительного соединения являются  основным  источником биологического  материала  при производстве лекарственных препаратов с антиоксидантными  свойствами [Стоник В.А., 2004]. В настоящее время проводится интенсивное изучение антикосидантных свойств некоторых растительного соединения происхождения  входящих в группу  ОН-содержащих полифенолы [Потапович, 2003]. Основным механизмом воздействия полифенолов являются антиоксидантное, антирадикальное и антигипоксическое.

В этой связи актуален поиск новых  с антиоксидантыми свойствами из растительного соединения является перспективным.

В данной работе представлены результаты исследования перекисного окисления липидов и антиоксидантной коррекция с помощью некоторых полифенольных соединений (рутин, эуфорбин и галловая кислота).

Материалы и методы. Анализы проводили на митохондрий печены крыс. Митохондрии выделяли из печени крыс массой 150-200 гр. методом дифференциального центрифугирования [Schneider., 2001]. Среда выделения митохондрий содержала 250 мМ сахарозы, 10 мМ трис-хлорида, 1 мМ ЭДТА, рН 7,4.

Индукцию неферментативного Fe²⁺/аскорбат-зависимого ПОЛ проводилис добавлением 10 мкМ FeSO₄ и 600 мкМ аскорбата. Инкубационная среда содержала 125 мМ КСI, 10мМ трис-НСI, рН 7,4. Количество белка митохондрий составляло 0,5мг на 1 мл среды инкубации.

Антиокисдантную активность исследуемых соединений измеряли по ингибированию Fe²⁺/аскорбат-зависимого набухания митохондрий печени крыс при длине волны 540 нм на фотометре ЛМФ-69. Выбор такого методического подхода обусловлен тем, что ранее была установлена линейная корреляционная взаимосвязь между интенсификацией процессов ПОЛ, индуцированного системой Fe²⁺/аскорбиновая кислота и набуханием митохондрий [Takei., 1994]. Пероксидация липидов в системе Fe²⁺/аскорбат на митохондриальной мембране оценивалась также другими авторами, измерением набухания митохондрий в условиях активации процессов ПОЛ [Almeida., 2006], что свидетельствует о пригодности использования этой модели, как тест-системы для изучения антиоксидантных свойств различных веществ.

Белок определяли по биуретовой реакции [ Gornal., 1949].

Структурные формулы фенольных соединений приведены в таблице 1.

Полученные результаты обрабатывали статистически с помощью программы “Origin 6.1”. Данные оценивали, используя параметрический t-критерий Cтьюдента, выражали в виде M±m. Достоверными считали результаты при р<0,05.

Результаты и их обсуждение.

Исследование роли перекисного окисления липидов (ПОЛ) в регуляции важнейших функций клетки представляет интерес по ряду причин. Индукция ПОЛ в Мх приводит к изменению проницаемости мембран, снижению мембранного потенциала, разобщению ОФ и гидролизу АТФ [Владимиров,  1998]. Влияние ПОЛ на функции Мх реализуется как на уровне прямого влияния продуктов ПОЛ на липидный матрикс мембран, так и различных опосредованных эффектов [Уткина., 2004; Оковитый., 2003]. Антиоксиданты способны нейтрализовать активность свободных радикалов, защищают фосфолипиды мембран клеток от окисления [Потапович, 2003; Уткина., 2005].

Нами было изучено действие фенольных соединений – рутин, эуфорбин, кверцетин на процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в мембранах митохондрий печени крыс в экспериментах in vitro.

В качестве индуктора ПОЛ была использована Fe²⁺/аскорбат.

В результате проведенных исследований обнаружено, что добавление Fe²⁺+аскорбата в среду инкубации увеличивало скорость набухания митохондрий на (t-300 сек)  45.3±1.76 (100%) по сравнению с контролем. Эксперименты показали, что внесение в среду инкубации Fe²⁺+аскорбата вызывает набухание митохондрий по сравнению с контролем, что указывает на ПОЛ и пермеабилизацию мембран митохондрий.

Исследование действия рутина на Fe²⁺/аскорбат индуцированного набухания митохондрий (табл.1) показало, что препарат в концентрации 1 мкМ ингибировал набухание митохондрий на 91.8±1.73 (8.20%). Значительное ингибирование набухания митохондрий отмечено при концентрациях рутина 2<5 мкМ, соответственно. Эксперименты показали, рутин оказывает концентрационно-зависимое ингибирующее влияние на набухание митохондрий(табл.1.).

Таблица 1.

Анализ антиоксидантной активности  рутина при Fe²⁺/аскорбат-индуцированном набухании митохондрий печени крыс в условиях in vitro

СИ: КСI - 125 мМ, трис-НСI - 10мМ, рН 7,4; Концентрации: FeSO₄ – 10 мкМ, аскорбата – 600 мкМ; белок митохондрий 0,5 мг/мл., контроль - Fe²⁺/аскорбат. n = 5.

Добавление рутин в среду инкубации в концентрации 2 мкМ на 71.9±2,14 (28.1%), 3 мкМ на 51.8±0.74 (48.2)%,  4 мкМ на 30.9±1.12 (69.1%) предотвращает эффект Fe²⁺/аскорбата  на ПОЛ. Эксперименты показали, что максимальная эффективность наблюдается при концентрации 5 мкМ рутин и при этом составила IС₅₀ = 3.08 мкМ (табл.1.).

А также, аналогичные результаты были получены при действии эуфорбина на Fe²⁺/аскорбат-индуцированное набухание митохондрий. Эуфорбин также эффективно ингибирует Fe²⁺/аскорбат-индуцированное набухание митохондрий. При исследовании эуфорбина в концентрациях 1 мкМ< 10 мкМ его ингибирующее действие на Fe²⁺-аскорбат-индуцированное набухание митохондрий оказался концентрационно-зависимым. С IC₅₀, равной 3,7±0,15 мкМ, что свидетельствует о наличии у исследуемого полифенола антиоксидантные свойства (рис.1.).

Рисунок 1. Действие эуфорбина на ПОЛ-индуцированное набухание митохондрий печени крыс

СИ: КСI - 125 мМ, трис-НСI - 10мМ, рН 7,4; Концентрации: FeSO₄ – 10 мкМ, аскорбата – 600 мкМ; белок митохондрий 0,5 мг/мл., контроль - Fe²⁺/аскорбат.

Рисунок 2. Действие мегосина на ПОЛ-индуцированное набухание митохондрий печени крыс

СИ: КСI - 125 мМ, трис-НСI - 10мМ, рН 7,4; Концентрации: FeSO₄ – 10 мкМ, аскорбата – 600 мкМ; белок митохондрий 0,5 мг/мл., контроль - Fe²⁺/аскорбат.

В дальнейшем мы изучали действие мегосина на систему ПОЛ, индуцированную Fe²⁺-аскорбатом (рис.3.). Мегосин также,  предотвращал эффект Fe²⁺–аскорбата на набухание митохондрий печени крыс. При исследовании флавоноида мегосин в концентрациях 0,05-0,5 мкМ его ингибирующее действие на Fe²⁺-аскорбат-индуцированное набухание митохондрий оказался концентрационно-зависимым. Эксперименты показали, что максимальная эффективность наблюдается при концентрации 0.5 мкМ мегосина, при этом составила IС₅₀ = 0.9 мкМ (рис.2).

Таким образом, нами установлено, что фенольные соединения:  рутин, эуфорбин, галловая кислота оказывают протекторное действие на митохондрии, уменьшая повреждающее действие Fe²⁺/аскорбат.

Список литературы:
1. Анисимов, В.Н. Эпифиз, биоритмы и старение организма / В.Н. Анисимов // Успехи физиологических наук. 2008. Т. 39., №4.- С. 40-65.
2. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты. // Вестник РАМН. - 1998. - №8. - С.43-51.
3. Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток (жизнь и смерть, созидание и разрушение). Физиологическиеклинико-биохимические аспекты / Е.Е. Дубинина. — СПБ.: Медицинская пресса, 2006. 400 с.
4. Оковитый С.В. Клиническая фармакология гепатопротекторов // Гепатология. ФАРМиндекс. Практик. – 2002. – № 3. – С. 30-39.
5. Потапович А.И., Костюк В.А. Сравнительное исследование антиоксидантных свойств и цитопротекторной активности флавоноидов // Биохим. – 2003. – 68, №5. – С. 632-638.
6. Уткина Е.А. Зависимость антиоксидантной активности флавоноидов от физико-химических характеристик в различных системах: Автореф. дис. ... канд.мед. наук. – Москва, 2005. – 25 c.
7. Хавинсон В.Х., Анисимов В.Н. Пептидные биорегуляторы и старение -СПб.: «Наука». 2003. -223 с.
8. Almeida A.M., Bertoncini C.R. Mitochondrial DNA damage associated with lipid peroxidation of the mitochondrial membrane induced by Fe2+-citrate // An. Acad. Bras. Cienc. – 2006. – 78. – P.505-514.
9. Gornal A.G., Bardawill C.J., David M. Determination of serum protein by means of biuret reaction // J. Biol. Chem. – 1949. – 177. – P. 751-766.
10. Harman, D. Free radical theory of aging: an update: increasing the functional life span / D. Harman // Ann N.Y. Acad. Sci. 2006. - Vol.1067. - P. 1021.
11. Takei M., Hiramatsu M., Mori A. Inhibitory effects of calcium antagonists on mitochondrial swelling induced by lipid peroxidation or amchidonic acid in the rat brain in vitro // Neurochem. Res. – 1994. - 19. – Р. 1199-1206.
12. Schneider W.C., Hogeboom G.H. Cytochemical studies of mammalion tissues: the isolation of cell components by differential centrifugation // Cancer. Res. – 1951. – 11. – P. 1-22.