Биотрансформация акрилонитрила иммобилизованной в структуре геля агарозы бактерии Rhodococcus ruber – 8/4/1

АННОТАЦИЯ

Изучен процесс биотрансформации акрилонитрила в акриламид иммобилизованными в структуру агарозного геля клеток Rhodococcus ruber -8/4/1. Подобраны оптимальные условия для иммобилизации. Показано, что конверсия акрилонитрила в акриламид клеточной биомассы иммобилизованной в структуру агарозного геля культуры R. ruber – 8/4/1 позволяет использовать иммобилизованные клетки в течении 4 циклов с образованием 10-11% акриламида.

ABSTRACT

The process of biotransformation of acrylonitrile into acrylamide by immobilized in agarose gel structure of Rhodococcus ruber - 8/4/1 cells has been studied. Optimum conditions for immobilization have been selected. It was shown that the conversion of acrylonitrile to acrylamide by cell biomass immobilized in the structure of the agarose gel of R. ruber - 8/4/1 allows the use of immobilized cells for 4 cycles with the formation of 10-11% acrylamide.

Ключевые слова: Rhodococcus ruber – 8/4/1, иммобилизованные клетки (ИК), гель агарозы, биоконверсия, акрилонитрил (НАК), акриламид (АА).

Keywords: Rhodococcus ruber – 8/4/1, immobilized cells (IC), agarose gel, bioconversion, acrylonitrile (AN), acrylamide (AA).

В настоящее время получение амидов и карбоновых кислот с использованием бактерии рода Rhodococcus с помощью их нитрилгидратазно-амидазного и нитрилазного пути метаболизма нитрилов является активно развивающимся направлением биотехнологии [1-4]. Биотехнологическим способом из соответствующих нитрилов могут быть получены такие продукты, как акриламид [5], акриловая кислота [6], никотинамид, никотиновая, изоникотиновая и пиколиновая кислоты [7-9], путем стереоселективного гидролиза получают энантиомерно чистые органические вещества, используемые в качестве интермедиатов при получении фармпрепаратов и химических веществ различного назначения [10, 11].

Как известно, интенсификация биотехнологических процессов может быть достигнута за счет иммобилизации микробных клеток. Применение иммобилизованных биокатализаторов имеет ряд преимуществ, среди которых их стабилизация, возможность внедрения непрерывных технологий, упрощение процедуры выделения и очистки конечных продуктов и снижение количества отходов [12, 13]. Использование ИК родококков при биотрансформации НАК повышает устойчивость клеток к токсичным действиям субстрата НАК и конечного продукта АА, увеличивая время работы биокатализатора без снижения нитрилгидратазной активности и выходом конечного продукта.

Цель данного исследования подбор оптимальных условий иммобилизации в структуру агарозного геля клеток Rhodococcus ruber- 8/4/1 и изучение процесса биотрансформации НАК в АА с использованием ИК.

В работе был использован штамм бактерии R. ruber-8/4/1 – продуцент нитрилгидратазы, депонированный под номером СКБ-318 коллекции микроорганизмов Института микробиологии АН РУз [14].

Клетки штамма R. ruber-8/4/1 обладающего нитрилгидратазной активностью, выращивали на среде ПС следующего состава (г/л): К₂НРО₄ – 0,5; КН₂РО₄ – 0,5; MgSO₄×7Н₂О – 1,0; Пептон – 2,0; Глюкоза – 10,0; Мочевина – 12,0; CoCl₂×6Н₂О – 0,03; с исходным значением рН 7.2-7.5. Культуру выращивали в конических колбах объемом 250 мл в 70 мл питательной среды при температуре 28°С при постоянном перемешивании со скоростью вращения 150 об/мин в течении 72 часов. Клеточную суспензию центрифугировали 10 мин., со скоростью вращения 12000 об/мин, клеточный осадок отмывали 10 мМ фосфатным буфером. Осадок клеток ресуспендировали в 10 мл фосфатным буфером.

Для ИК в структуру агарозного геля использовали агарозу в различных концентрациях. Агарозу нагревали до температуры кипения, затем охлаждали до 35-40 ^оС и смешивали с бактериальной суспензией клеток, с таким расчётом, чтобы конечная концентрация агарозы составила от 0.5 до 3.0%. Полученную суспензию клеток разливали в 96 луночный планшет объемом 0.2 мл каждой лунки. После застывания получали гранулы, которые в дальнейшем использовали для биотрансформации.

Биотрансформацию НАК в АА иммобилизованными в структуру агарозного геля клетками R. ruber-8/4/1 проводили в 10 мМ фосфатном буфере (рН=7.0-7.2). В колбу объёмом 100 мл с 50 мл фосфатным буфером помещали гранулы ИК. Для изучения устойчивости ИК к НАК, НАК вносили как одноразово, так и дробно в концентрации от 0.6 до 12%. Время конверсии от 20 до 180 минут.

Концентрацию АА в реакционной смеси анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на приборе LKB HPLC-system, используя колонку Силосорб SPHC₁₈ (150×4 мм, 8 мкм) или DISCOVERY-C18 (75×4 мм, 5 мкм), УФ-детектор фильтром 206 нм, потоком подвижной фазы 1 мл/мин следующего состава: 10 мМ фосфатный буфер – 97.0%, CH₃CN – 3.0%, рН=2.5 (доводили с ортофосфорной кислотой). В качестве контроля использовали серийные разведения чистых препаратов АА.

Операционную стабильность иммобилизованного биокатализатора оценивали по сохранению нитрилгидратазной активности при последовательном проведении биотрансформации НАК, вносимого в каждом цикле. Цикл реакции представляет собой полную конверсию НАК вносимого в реакционную среду с концентрацией 14%, с последующей промывкой гранул ИК водой или 10 мМ фосфатным буфером.

В настоящее время, биотехнологическое производство акриламида основано, главным образом, на использовании высокопродуктивных штаммов R. rhodochrous J1 и R. rhodochorous M8, M33 [6, 15]. В результате проведенных экспериментов были подобраны условия для иммобилизации на агарозе клетки R. ruber - 8/4/1, оптимальным объёмным соотношением клеточной массы и агарозы составляет 1:1 (об/об), с концентрацией агарозы 0.8-1.0%. Показано, что при концентрации клеток 10-12 мг/мл происходит полное связывание клеток с агарозой. Подобранные условия иммобилизации обеспечили высокую концентрацию жизнеспособных клеток, способствовали равномерному распределению клеточной массы внутри гранул агарозы и увеличили механическую прочность биокатализатора.

Было изучено влияние НАК на устойчивость ИК. НАК вносили в реакционную среду в концентрации от 1.2 до 12 %. Установлено, что при одновременном внесении НАК в концентрации 1.2-2.4% через 30 мин степень конверсии составила 50% и 86%, соответственно. Полная конверсия НАК в АА была получена через 90 мин конверсии и составила 98% и 97% соответственно, тогда как через 180 мин конверсии наблюдается трансформация АА в акриловую кислоту (АК) в обеих концентрациях. При внесении НАК в концентрации 4.8% полная конверсия была достигнута через 90 и 180 мин конверсии и составила – 100%.

Таблица 1.

Биоконверсия НАК клетками Rhodococcus ruber – 8/4/1 включёнными в структуру геля агарозы при одновременном внесении НАК

При дальнейшем увеличении НАК в концентрациях 9.6 и 12.0% в течении 180 мин степень конверсии уменьшается и составляет 60.0% и 33.3%. Установлено, что ИК способны выдерживать высокие концентрации НАК длительное время. Показано, что при одновременном внесении НАК в концентрации 4.8% в течении 90 мин клетки полностью конвертируют НАК в АА, тогда как при концентрации НАК 9.6 и 12.0% ИК теряют свою активность. Возможно, устойчивость штамма к высоким концентрациям НАК 4.8% - 7.2% объясняется тем, что культура была выделена из почв на территории предприятия по производству НАК.

При дробном внесении НАК в реакционную среду при достижении НАК в концентрации 3.6% степень конверсии составилa 77%, при дальнейшем внесении НАК степень конверсии не изменяется и варьирует в пределах 73-88%.

Таблица 2.

Биоконверсия НАК клетками Rhodococcus ruber 8.4.1 включёнными в структуру геля агарозы при дробном внесении НАК

Следует учитывать, что при воздействии НАК на клетки одновременно начинается гидролиз, который сопровождается накоплением АА, таким образом, воздействие на клетки становится многофакторным, включающим влияние токсического субстрата и продукта реакции. Ранее было установлено, что нативные клетки способны выдерживать АА, который накапливается в реакционной среде в процессе конверсии, в концентрации 10-12%. Установлено, что после иммобилизации устойчивость клеток к АА увеличивается и составляет не менее 14-16%. Следовательно, НАК вносимый, в реакционную среду также оказывал токсическое действие на клетки, тогда, когда его вносили с коротким интервалом времени. При увеличении интервала времени вносимого НАК с 20 мин до 30 мин степень конверсии увеличивается и составляет не менее 80-88%.

Для того чтобы оценить операционную стабильность биокатализатора, проводили последовательные циклы конверсии субстрата, после каждого цикла биокатализатор отделяли от реакционной среды, промывали 10 мМ фосфатным буфером и использовали в дальнейших реакциях. При определении операционной стабильности клеток иммобилизованных в структуру агарозного геля установлено, что ИК не теряли своей активности при проведении повторных циклов трансформации НАК в АА в течении 4 циклов, c сохранением активности 85, 78, 70% от исходной активности соответственно. Снижение нитрилгидратазной активности клеток наблюдается только к 5-му циклу и составило не более 40% от исходной активности (Рисунок 1).

Рисунок 1. Операционная стабильность клеток штамма Rhodococcus ruber – 8/4/1 иммобилизованных в структуру геля агарозы

Снижение ферментативной активности при многократной конверсии субстрата может происходить либо в результате ингибирования фермента, либо из-за десорбции клеток и вымывания их из реакционной среды. В наших исследованиях потеря активности происходила, главным образом, вследствие ингибирования клеток высокими концентрациями токсического продукта реакции, в частности АА.

Следует отметить, что при достижении АА в реакционной среде 8-10% с использованием свободных клеток, цикл заканчивается, клетки невозможно использовать повторно, тогда как при иммобилизации микробных клеток, клетки возможно использовать в течении 3-4 циклов.

Таким образом, установлено, что включение клеток в структуру агарозы позволяет получить достаточно стабильный биокатализатор, так как не происходит потерь клеток из агарозного геля. Преимуществом использования иммобилизованных в структуру агарозного геля микробных клеток в возможности использования их в течении 4 циклов с образованием 10-11% АА. Недостатком использования агарозного геля является потеря активности микробной биомассы с сохранением активности 75% в процессе иммобилизации из-за температуры, используемой в процессе иммобилизации.

Список литературы:
1. Дебабов В.Г., Яненко А.С. Биокаталитический гидролиз нитрилов // Обзорный журнал по химии. – 2011. – Т. 1. – № 4. – С. 376–394.
2. Martínková L., Křen V. Biotransformations with nitrilases // Curr. Opin. Chem. Biol. – 2010. – V. 14. – P.130–137.
3. Kim D., Choi K.Y., Yoo M., Zylstra G.J., Kim E. Биотехнологический потенциал биодеградации Rhodococcus // J. Microbiol. Biotechnol. – 2018. – V.28 (7). – P. 1037-1051.
4. Забазная, Е.Б., Козулин С.В., Воронин С.П. Отбор штаммов, трансформирующих акрилонитрил и акриламид в акриловую кислоту // Прикл. биохим. микробиол. – 1998. – Т. 34, № 4. – С. 377–381.
5. Watanabe I. Optimal conditions for cultivation of Rhodococcus sp. N-774 and for conversion of acrylonitrile to acrylamide by resting cells //Agric. Biol. Chem. – 1987. – V. 51(12). – P. 3201–3206.
6. Nagasawa T., Nakamura T., Yamada Y. Production of acrylic acid and methacrylic acid using Rhodococcus rhodochrous J1 nitrilase //Appl. Microbiol. Biotchnol. –1990. –V. 34. –P. 322–324.
7. Webster N.A., Ramsden D.K., Hughes J. Comparative characterisation of two Rhodococcus species as potential biocatalysts for ammonium acrylate production //Biotech. Lett. – 2001. – V. 23. – P. 95–101.
8. Almatawah Q.A. Cowan D.A. Thermostable nitrilase catalysed production of nicotinic acid from 3-cyanopyridine // Enzyme Microb. Technol. – 1999. – V. 25. – P. 718–724.
9. Mathew C.D., Nagasawa T., Kobayashi Yamada H. Nitrilase-catalyzed production of nicotinic acid from 3-cyanopyridine in Rhodococcus rhodochrous J1 // Appl. Environ. Microbiol. – 1988. – V. 54. – P. 1030–1032.
10. Максимова Ю.Г., Васильев Д.М., Овечкина Г.В., Максимов А.Ю., Демаков В.А. Трансформация 2 и 4 цианопиридинов свободными и иммобилизованными клетками нитрилгидролизующих бактерий // Прикл. биохим. микробиол. –2013. – Т. 49. – № 4. – С. 358–363.
11. Елькин А.А., Гришко В.В., Ившина И.Б. Окислительная биотрансформация тиоанизола клетками Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 66 // Прикл. биохим. микробиол., – 2010, –Т. 46, – № 6, – С. 637–643
12. Синицын А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И., Спасов С.Д. //Иммобилизованные клетки микроорганизмов – М. Изд-во МГУ. –1994. – C. 288.
13. Куюкина М.С., Коршунова И.О., Рубцова Е.В., Ившина И.Б. Методы иммобилизации микроорганизмов для динамических атомно-силовых исследований (обзор) // Прикл. биохим. микробиол. – 2014.–Т. 50, – № 1,– С. 7–16.
14. Патент РУз IAP №05723 от 28.12.2018г. Штамм бактерий Rhodococcus ruber – 8/4/1 – продуцент нитрилгидратазы // Патент Узбекистана №05723 от 28.12.2018г /Махсумханов А.А., Алимова Б.Х., Пулатова О.М. [и др.].
15. Kobayshi M., Komeda H., Ynaka N. Nitrilase from Rhodococcus rhodochrous J1. Sequencing and overexpression of the gene and identification of an essential cysteine residue //J.Biol.Chem. – 1992. –V.267, – №.29, – P. 20746-20751.
16. Рогачева С.М., Игнатов О.В. Респираторная активность микробных клеток Rhodococcus rhodochrous М8, продуцирующего акрилонитрил-гидролизующие ферменты // Прикл. биохим. микробиол. – 2001. – Т. 37, – № 3, – С. 326–331.