Оптимизация условий культивирования штамма Rhodococcus ruber - 8/4/1 – продуцент нитрилгидратазы

АННОТАЦИЯ

В статье приведены данные по подборе оптимальных условий культивирования штамма Rhodococcus ruber – 8/4/1 для повышения активности нитрилгидратазы как в условиях качалки, так и в условиях ферментера. Оптимальная температура для роста и развития штамма является 28-30 ^оС с исходным значением рН питательной среды – 7.5, скорость вращения качалки или мешалки ферментёра – 120-150 об./мин и количество вносимого инокулята – 1-4%. Следует отметить, что культивирование штамма R. ruber – 8/4/1 на ферментере, приводит к повышению удельной активности нитрилгидратазы в 3-4 раза по сравнению с вариантом, когда использовали качалки.

ABSTRACT

This paper describes experimental data on the selection of optimal cultivation conditions for the Rhodococcus ruber – 8/4/1 strain to increase nitrile hydratase activity for both shaker incubator and fermenter conditions. The optimum temperature for the strain’s growth and development is 28-30 °C with the initial pH of the liquid medium being 7.5, rotation speed of the shaker or the propeller of the fermenter is 120-150 rpm and the amount of inoculum – 1-4%. It should be noted that cultivation of the R. ruber – 8/4/1 strain in the fermenter leads for increasing of the specific activity of nitrile hydratase by 3-4 times compared to the used shaker incubator.

Ключевые слова: Rhodococcus ruber – 8/4/1, активность нитрилгидратазы, биомасса, культивирование, температура, рН среды, ферментер, качалка.

Keywords: Rhodococcus ruber – 8/4/1, nitrile hydratase activity, biomass, cultivation, temperature, pH of medium, fermenter, shaker.

Для успешной реализации процесса ферментации с микроорганизмами-продуцентами биологически и физиологически активных соединений необходимо подобрать оптимальные условия культивирования. И это является ключевым звеном для их практического применения в соответствующих областях промышленности или производства. Большинство микроорганизмов требовательны к условиям культивирования на искусственных питательных средах, таких как лабораторные термостаты, шейкер-инкубаторы (качалки) или ферментеры от 1 литра до нескольких тысяч кубических метров. Во время роста и развития на этом оборудовании микроорганизмы находятся под влиянием абиотических (температура, кислотность, аэрация) и биотических (количество биомассы) факторов окружающей среды. Эти факторы напрямую определяют качество получаемого продукта и влияют на биокаталитическую активность выбранного штамма [1-5].

Целью данной работы являлось подбор оптимальных условий культивирования штамма R. ruber-8/4/1 для получения биокаталитически активной биомассы, содержащей фермент нитрилгидратазы.

В работе был использован штамм бактерии R. ruber-8/4/1 – продуцент нитрилгидратазы, депонированный под номером СКБ-318 коллекции микроорганизмов Института микробиологии АН РУз [6].

Для выращивания штамма R. ruber– 8/4/1 была использована питательная среда «ПС» следующего состава (г/л): К₂НРО₄ – 0,5; КН₂РО₄ – 0,5; MgSO₄х7Н₂О – 1,0; Пептон – 2,0; Глюкоза – 10,0; Мочевина – 12,0; CoCl₂х6Н₂О – 0,03; Полиэтиленгликоль – 5,0.

Штамм R. ruber– 8/4/1 выращивали глубинным способом на круговой электромагнитной качалке и ферментере объёмом 5 литров «Biotron» (Корея) в течение от 3-х до 5 суток в зависимости от цели эксперимента. За единицу удельной нитрилгидратазной активности принимали количество белка, содержащейся в 1 мг сухого веса клеток, катализирующей образование 1 мкмоль акриламида в минуту (мкМ амид/мг сух.вес.×мин). Концентрацию акриламида анализировали методом ВЭЖХ на приборе LKB HPLC-system, используя колонку Силосорб SPH C₁₈ (150×4мм, 8 мкм) или DISCOVERY-C₁₈ (75×4мм, 5 мкм), УФ-детектор фильтром 206 нм, потоком подвижной фазы 1.0-1.5 мл/мин следующего состава: 10 мМ фосфатный буфер– 97%, CH₃CN – 3%, рН=2.5 (доводили с ортофосфорной кислотой). В качестве контроля использовали серийные разведения чистых препаратов акрилонитрила и акриламида. Количественное содержание акриламида в образце определяли по калибровочной кривой акриламида на ВЭЖХ.

Биотрансформацию акрилонитрила в акриламид проводили в конических колбах Эрленмейера с притертой крышкой объемом 100 мл содержащих 10 мл или 20 мл суспензии клеток штамма. К клеточной суспензии дробно добавляли 0,5-0,6% акрилонитрил. Реакцию проводили при 20-25 ^oС. Из реакционной среды при определенном отрезке времени отбирали по 1 мл пробы и определяли количество образовавшегося акриламида.

Для определения зависимости нитрилгидратазной активности от температуры культивирования штамм R. ruber-8/4/1 выращивали в течение 120 часов на круговой электромагнитной качалке 120-150 об/мин при температуре от 20 ^оС до 40 ^оС (Рисунок 1). В результате проведенных исследований было установлено, что штамм R. ruber-8/4/1 медленно растет при температуре 40 ^оС, активность нитрилгидратазы не превысила 50 Ед/мг. Из рисунка 1 видно, что более выраженные показатели по активности фермента наблюдалось, когда штамм выращивали при температуре от 25 ^оС до 35 ^оС с показателями нитрилгидратазной активности 410 Ед/мг и 340 Ед/мг, соответственно. Необходимо отметить, что культивирование штамма при температуре 30 ^оС приводит активному росту штамма с высокой нитрилгидратазной активностью (425 Ед/мг). Литературными данными показано, что скорость образования кислоты при биотрансформации акрилонитрила клетками R. erythropolis Pla и РЗ снижается при температуре выше 45°С. Очевидно, это связано со снижением нитрилгидратазной, но не амидазной активности [7]. Это согласуется с известными данными относительно температурного профиля активности Fe-зависимых нитрилгидратаз: для ферментов P. chlororaphis В23 и R. erythropolis R312 температурный оптимум которых составляет 20 °С и 35 °С, соответственно [8, 9].

Полученные данные показали, что для оптимального накопления биомассы с высокой нитрилгидратазной активностью штамм R. ruber-8/4/1 достаточно культивировать в течение 96-120 часов при температуре от 25 ^оС до 30 ^оС.

Рисунок 1. Влияние температуры культивирования на активность нитрилгидратазы штамма Rhodococcus ruber - 8/4/1

Профиль зависимости активности нитрилаз и нитрилгидратаз от кислотности среды хорошо изученных продуцентов достаточно сходен. Оптимум рН для них находится в пределах 6.0-8.0 [3]. Для установления оптимума рН питательной среды, штамм R. ruber - 8/4/1 выращивали на питательной среде с рН значениями от 6.0 до 9.0 (Рисунок 2). Данный штамм хорошо растет в широком диапазоне рН значений, но высокая нитрилгидратазная активность проявляется в диапазоне рН 7,0-7,5. Из рисунка 2 видно, что культивирование штамма при указанном диапазоне рН значений в течение 96-120 часов демонстрирует синтез нитрилгидратазы с высокой активностью 385 Ед/мг и 430 Ед/мг соответственно. Необходимо отметить, что при значении рН ниже 7,0 или выше 7,5 штамм растет очен медленно проявляя низкую ферментативную активность.

Рисунок 2. Влияние рН питательной среды на активность нитрилгидратазы штамма Rhodococcus ruber - 8/4/1

Следует отметить, что наиболее благоприятным условием для роста и развития штамма для образования высокоактивного фермента является рН питательной среды 7,5.

Оптимальной для ведения процесса культивирования родококков является интенсивность перемешивания при 150 об/мин. Увеличение интенсивности перемешивания среды приводит к нарушению процесса массообмена в ней в связи с образованием пены и конгломератов биомассы культивируемых родококков [10]. В связи с этим, нами было изучено влияние перемешивание и аэрации питательной среды на рост, развитие и активность нитрилгидратазы штамма R. ruber - 8/4/1. Из таблицы 1 видно, что перемешивание питательной среды со скоростью 120-150 об./мин благоприятно влияет на рост штамма. В этих условиях штамм образует 3,5 мг/мл и 3,6 мг/мл сухой биомассы в системе объемами 0,5 л и 1,0 л соответственно. Также обнаружено, что активность нитрилгидратазы коррелируется с образованием биомассы при скорости вращения до 150 об./мин. При увеличении интенсивности перемешивания до 200 об./мин наблюдается снижение значений по количеству биомассы и активности фермента.

Обрашает внимание то, что увеличение обшего объема питательной среды до 1 литра положительно влияет на показатели по биомассе и активности фермента, показав максимум по биомассе 3,6 мг/мл и по активности 430 Ед/мг соответственно. Аналогичные данные были получены при культивировании штамма Rhodococcus rhodochrous М33 [11].

Таблица 1.

Влияние аэрации на рост и активность нитрилгидратазы штамма Rhodococcus ruber – 8/4/1

В зависимости от поставленной задачи в этой работе, для апробации или имитации укрупненных испытаний в производственных условиях необходимо было культивировать штамм R. ruber - 8/4/1 в большом объёме. Для оптимизации условий культивирования штамм выращивали в ферментере периодическим методом в течение 7 суток при постоянном перемешивании с подачей стерильного воздуха и термостатированием при 28-30 ^оС. Скорость аэрации составила 0.5-1.0 объем/объем/мин. Эксперименты ставили в 2-х вариантах с содержанием питательной среды ПС в объеме 1 и 2 литра. Инокулятом служила 48 часовая культура штамма, предварительно выращенная в колбах Эрленмейера на качалке при температуры 28-30 ^оС, при перемешивании 120 об/мин. Инокулят вносили в объеме 1% (об/об). Из таблицы 2 видно, что активность нитрилгидратазы штамма R. ruber - 8/4/1 достигает максимума на 5-6 сутки культивирования в обоих вариантах с активностью нитрилгидратазы 1950 Ед/мг и 1450 Ед/мг соответственно.

Таблица 2.

Динамика роста и активности нитрилгидратазы штамма Rhodococcus ruber – 8/4/1 при культивировании на ферментере

При культивировании в ферментере наибольшее накопление биомассы наблюдалось на 5 сутки ферментации, с содержанием биомассы 5,5 мг/мл и 6,5 мг/мл (соответственно). Следует отметить, что при культивировании в ферментере, в динамике роста и развития штамма R. ruber - 8/4/1 наблюдается четкая корреляция между образованием биомассы и активностью фермента.

Для исследования влияния количества вносимого инокулята, в ферментационную среду вносили разные концентрации 48 часовой культуры штамма R. ruber – 8/4/1. Инокуляты вносили в количестве от 1% до 5%. В таблице 3 показано, что количество биомассы достигало максимальной точки при внесении инокулята в количестве 4% по объему в обоих вариантах. Но, активность нитрилгидратазы была достаточно высока при внесении инокулята в количестве 1-2%. Необходимо отметить, что внесенные все дозы инокулята положительно влияли на образование и активность фермента. Из таблицы 3 видно, что в 1 варианте эксперимента с использованием 1 л питательной среды «ПС» активность нитрилгидратазы была больше на 35% (2000 Ед/мг), чем активность фермента полученная во втором варианте эксперимента (1500 Ед/мг). Эти данные наводят на мысль о том, что для каждого продуцента необходим индивидуальный подход для выбора оптимальных условий культивирования.

Таблица 3.

Влияние количества инокулята на рост и активность нитрилгидратазы штамма Rhodococcus ruber – 8/4/1 при культивировании в ферментере

В ходе экспериментальных работ, на образование биомассы штамма было изучено влияние скорости перемешивания ферментера и барботирование стерильным воздухом. Повышение скорости мешалки более чем 200 об/мин и барботирование воздухом более чем на 2 объем/объем/мин приводит к вспениванию ферментационной жидкости, потери биомассы и снижению эффективности культивирования. Добавление полиэтиленгликоля с мол.массой 2000 Да в качестве пеногасителя в количестве 0,5% положительно влияло на процесс ферментации штамма R. ruber – 8/4/1.

Анализ проведенных исследований показал, что ферментативно-активная биомасса по нитрилгидратазе достигает максимальной точки на 4-5 сутки при культивировании на лабораторных качалках и на 5-6 сутки на ферментере.

Таким образом, в результате проведенных исследований подобрано оптимальное условие культивирования штамма R. ruber – 8/4/1 для повышения активности нитрилгидратазы. Установлено, что оптимальная температура для роста и развития штамма является 28-30 ^оС с исходным значением рН питательной среды – 7,5, скорость вращения качалки или мешалки ферментёра – 120-150 об/мин и количество вносимого инокулята – 1-4%. Следует отметить, что культивирование штамма на ферментере приводит к повышению активности нитрилгидратазы в 3-4 раза по сравнению с вариантом, где использовали качалки.

Список литературы:
1. Самсонова А.С. Оптимизация условий глубинного культивирования микроорганизмов-деструкторов жировых веществ. Вестник НАН Беларуси, – 2014, – №4, – С. 63–66.
2. Мухутдинова А.Н. Влияние условий культивирования Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 647 на биодеструкцию дротаверина гидрохлорида - фармацевтического экотоксиканта. Вестник Пермского университета. – 2014, – С. 39–42.
3. Патент RU 2223316. 2004. Штамм бактерий Rhodococcus ruber – продуцент нитрилгидратазы. / Демаков В.А., Максимов А.Ю., Аликин В.Н., Кузнецова М.В., Овечкина Г.В., Будников В.И., Федченко В.Н., Федченко Н.Н., Кузьмицкий Г.Э., Черешнев В.А.
4. Патент RU 2304165. 2007. Способ получения акриловых мономеров и штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous для его осуществления. / Полякова И. Н., Яненко А.С., Ларикова Г.А., Леонова Т.Е., Дебабов В.Г., Герасимова Т.В.
5. Kim B-Y., Kim J-C., Lee H-H., Hyun H-H., "Fed-batch Fermentation for Production of Nitrile Hydratase by Rhodococcus rhodochrous М33", Biotechnol. Bioprocess Eng., – 2001, – 6:11–17.
6. Патент РУз №IAP 05723. 2018. Штамм бактерий Rhodococcus ruber - 8/4/1 – продуцент нитрилгидратазы. / Махсумханов А.А., Алимова Б.Х., Пулатова О.М., Камбаралиева М.И., Ташбаев Ш.А.
7. Козлов С.В. Биологическая характеристика бактериальных штаммов-активных продуцентов нитрилгидролизующих ферментов: дис. ... канд. биол. наук. – Пермь, 2007. – 139 с.
8. Osprian I., Jarret C., Strauss U. Large-scale preparation of a nitrile-hydrolysing biocatalyst: Rhodococcus R312 (CBS 717.73). J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. – 1999. – V.6, – N.6, – P. 555–560.
9. Nishiyama T., Horinouchi S., Kobayashi M. Cloning and characterization of genes responsible for metabolism of nitrile compounds from Pseudomonas chlororaphis B23. J. Bacteriol. – 1991. – V.173, – P. 2465–2472.
10. Кузнецова М.В. Физиолого-биохимическая характеристика штаммов рода Rhodococcus – продуцентов нитрилгидратазы: дис. …канд. биол. наук. – Пермь, 2004. – 123 с.
11. Патент РФ 2340667. 2008. Способ культивирования штамма Rhodococcus rhodochrous М33, продуцирующего нитрилгидратазу. / Лоренц Й., Воронин С.П., Козулин С.В., Сингирцев И.Н., Дебабов В.Г., Яненко А.С.