Изучение эндотелий - зависимое вазорелаксантное действие флавоноида хризина

АННОТАЦИЯ

В настоящей работе изучена роль эндотелия в релаксантном действии флавониода хризина. Анализ полученных данных позволяет предположить, что релаксантное действие хризина в условиях фенилэфрин индуцированной контрактуры является эндотелий–зависимым и обусловлено  активаций NO/гуанилатциклазной системы.

ABSTRACT

In this paper, the role of the endothelium in the relaxant effect flavonoid chrysin has been studied. The results of these experiments indicate that the relaxant effect of the flavonoid chrysin - under conditions of phenylephrine-induced contracture is endothelium-dependent and, possibly, mediated by its interaction with the NO- synthase system and its activation.

Ключевые слова: флавоноид, гладкомышечные клетки, аорта крысы, эндотелия,  NO/гуанилатциклаза, релаксантная действия.

Keywords: flavonoid, smooth muscle cells, rat aorta, endothelium, NO/гуанилатциклаза, relaxant action.

Ведущую роль в регуляции функционального состояния кровеносных сосудов играет эндотелий, который контролируя  их тонус и, соответственно,  артериальное давление, участвует в обеспечении оптимального уровеня кровоснабжения органов и тканей к их метаболическим потребностям [1; с. 302-312]. Установлено, что эндотелиальные клетки продуцируют ряд сосудорасширяющих и сосудосуживающих факторов, которые, модулируя сократительную активность гладкомышечных клеток (ГМК), играют важную роль в регуляции сосудистого тонуса [2; с.373–376].

Вместе с тем к настоящему времени накоплены многочисленные данные свидетельствующие о ключевой роли нарушений функции эндотелия в развитии многих заболеваний сердечно-сосудистой системы таких как атеросклероз, артериальная гипертензия, хроническая сердечная недостаточность и сахарный диабет [3;с. 640–642; 4; с.801-809]. Эти данные  свидетельствуют о том, что эндотелий участвует не только в регуляции сосудистого тонуса, но и непосредственно связан с процессами лежащими в основе  патогенеза  многих заболеваний [5; с. 1928-1929; 6; с. 1631-1674].

Учитывая центральную роль  дисфункции эндотелия в  патогенеза многих заболеваний разработка новых подходов коррекции нарушений функции  эндотелия является одной из актуальных задач современной экспериментальной фармакологии.

В настоящее время при создании протекторов нарушений функции эндотелия в качестве наиболее перспективных соединений рассматриваются растительные флавоноиды, которые обладают выраженным антиоксидантным, вазопротекторным и кардиопротекторным действием  [7; с1874-84, 8; с.46–52]. В связи с этим целью настоящих исследований было изучение особенностей вазорелаксантного действия флавоноида хризина и оценка роли в его обеспечении.

Материал и методы исследований

При выполнении настоящей работы использовано флавоноид хризин выделенный из растения вида Scutellaria phyllostachya Juz.

Эксперименты проводились на препаратах, представляющих собой кольца шириной ~3–4 мм, выделенных из аорты белых беспородных крыс (150–200 гр) и помещенных в специальную камеру (5 мл), перфузируемую физиологическим раствором Кребса–Хензелайта. Эксперименты выполнялись в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению биомедицинских исследований с использованием животных», принятыми Международным советом медицинских научных обществ (CIOMS) в 1985 г. В экспериментах использовали модифицированный раствор Кребса–Хензелайта следующего состава (мМ): NaCl – 158,3; KCl – 4; CaCl₂×2H₂O – 2; MgСl₂×2H₂O – 1,5; NaHCO₃ – 10; NaH₂PO₄×H₂O – 0,42; глюкоза – 5,6 (рН=7,4). Растворы оксигенировали карбогеном (О₂–95%, СО₂–5%), а температура раствора поддерживалась на уровне +37±0,5°С с помощью ультратермостата U–8 (Болгария). Для регистрации сократительной активности кольца аорты подвешивались с одной стороны к неподвижному крючку экспериментальной камеры, а с другой стороны – к датчику механотрона FT–03 (Grass Instrument Co., США), предназначенного для измерения изометрического напряжения. Перед экспериментом сегменты аорты предварительно растягивали нагрузкой 1 гр. (~9,8 мН) и промывали физиологическим раствором в течение ~45–60 минут для достижения равновесия.

Для оценки роли эндотелия в вазорелаксации, вызываемой флавоноидом хризином, эндотелиальный слой аорты крысы удаляли механически с помощью миниатюрных ватных тампонов. Проверку наличия эндотелия осуществляли с помощью ацетилхолина, который вызывает релаксацию препаратов аорты  предварительно сокращенных фенилэфрином или гиперкалиевым  раствором при наличии интактного эндотелия [9; с. 1237–1244].

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ OriginLab OriginPro v. 8.5 SR1 (EULA, Northampton, MA 01060–4401, США). Полученные результаты в экспериментах подвергали статистической обработке с использованием t–критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Ранее нами было показано, что флавоноид хризин обладает выраженным вазорелаксантным действием и вызывает расслабление препаратов аорты крысы, предварительно сокращенных фенилэфрином и гиперкалиевым  раствором [10; с. 14-19].

При дальнейшем изучении эффектов  хризина на препаратах аорты крысы с удаленным эндотелием нами было обнаружено, что хризин  в этих условиях сохраняет способность вызывать  расслабление препаратов, предсокращенных фенилэфрином, но не в такой степени как на препаратах с интактным эндотелием. При этом на препаратах аорты с интактным эндотелием хризин (100 мкМ) вызывал расслабление препаратов, предсокращенных фенилэфрином, на 92,18±3,1%, а на препаратах с удаленным эндотелием он вызывал расслабление только на 22,7±3,2% (рис.1).

Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что в реализации вазорелаксантного действия хризин важную роль могут  играть эндотелиальные клетки и синтезируемые ими вазоактивные факторы. При этом сохранение незначительного вазорелаксантного эффекта хризина, на препаратах с удаленным эндотелием, указывает на то, что в этих условиях его эффект связан с его влиянием на сократительный аппарат гладкомышечных клеток.

Рисунок 1. Зависимость вазорелаксантного действия хризина от наличия и отсутствия эндотелия у  препаратов аорты крысы

По оси ординат сила сокращения препарата аорты, выраженная в процентах от силы, индуцированной 1 мкМ фенилэфрином и принятой за 100%. (P<0,05; n=5)

Ведущую роль в процессах расслабления (вазодилатации) гладкой мускулатуры играет оксид азота (NO), продуцируемый в эндотелиальных клетках NO-cинтазой [11; с. 122–131; 12; с.490-497]. Предполагая возможность того, что вазорелаксантное действие хризина может быть опосредовано через его влияние на продукцию NO, нами были изучены эффекты флавоноида в присутствии ингибитора NO-cинтазы – L-NAME. Как показали результаты этих экспериментов, предварительная инкубация интактных препаратов аорты с 100 мкМ L-NAME приводит к существенному подавлению  способности хризина расслаблять препараты, предсокращенные фенилэфрином (рис. 2).

Рисунок 2. Влияние L-NAME  и метиленового синего на вазорелаксантное действие хризина, в условиях фенилэфрин - индуцированной контрактуры

По оси ординат сила сокращения препарата аорты, выраженная в процентах от силы, индуцированной 1 мкМ фенилэфрином и принятой за 100%.  (P<0,05; n=6)

Результаты этих экспериментов могут свидетельствовать о том, что вазорелаксантное действие хризина, по-видимому, является эндотелий – зависимым и, возможно, обусловлено его влиянием на  систему NO- синтазы и подавлением синтеза NO. При этом  подавление  синтеза  NO и снижение  его поступления в ГМК может приводить к недостаточной активации гуанилатциклазной системы и уменьшению продукции циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) [13;с. 212]. Снижение уровня цГМФ в ГМК, в свою очередь, может приводить к ингибированию протеинкиназы G (РКGI) сопровождаемого инактивацией Са²⁺-транспортирующих систем и последующим уменьшением внутриклеточной концентрации Са²⁺ в ГМК  и их расслаблением. Дополнительное подтверждение такого механизма действия хризина нами было получено в экспериментах с метиленовым синим – специфическим ингибитором гуанилатциклазы [14; с. 231–236]. Как можно видеть на рис.2, предварительная инкубация препаратов аорты с метиленовым синим также сопровождалась существенным снижением релаксантного действия хризина, в условиях фенилэфрин-индуцированной контрактуры.

Результаты этих экспериментов являются убедительным подтверждением того, что релаксантное действие хризина реализуется благодаря модуляции активности NO/гуанилатциклазной системы.

В эндотелиальных  клетках наряду с NO также продуцируется  другой эффективный вазорелаксирующий фактор – простагландин РGI2, синтез которого обеспечивает циклооксигеназа. Вазорелаксантный эффект РGI2 реализуется благодаря активации аденилатциклазы, сопровождаемой  стимуляцией продукции цАМФ  и  процессов приводящих к снижению уровня Ca²⁺ в ГМК и последующему их расслаблению [15; с. 894–912]. В наших экспериментах предварительная инкубация препаратов аорты с индометацином – специфическим ингибитором циклооксигеназы, существенно не влияла  на вазорелаксантную  эффективность хризина (рис.3).

Эти результаты свидетельствуют о том, что вазорелаксантное  действие хризина не связано с его взаимодействием с  аденилатциклазной системой.

Таким образом, результаты, полученные в этой серии экспериментов, убедительно свидетельствуют о том, что хризин обладает выраженным эндотелий – зависимым вазорелаксантным действием. При этом существенное подавление вазорелаксантного эффекта хризина ингибиторами  NO- синтазы L-NAME и гуанилатциклазы метиленовым синим, является убедительным свидетельством  его взаимодействия  с NO/гуанилатциклазной системой.

Рисунок 3. Влияние индометацина на вазорелаксантное действие хризина в условиях фенилэфрин – индуцированно й контрактуры

По оси ординат сила сокращения препарата аорты, выраженная в процентах от силы, индуцированной 1 мкМ фенилэфрином и принятой за 100%. (P<0,05; n=6)

В целом, на основании полученных данных можно заключить, что вазорелаксантный эффект хризина имеет эндотелий-зависимый характер и в основном обеспечивается благодаря активации NO-гуанилатциклазной системы, сопровождаемой  уменьшением  внутриклеточного уровня ионов Са²⁺ в ГМК и их релаксацией. При этом ключевую роль, по-видимому, играет ПКGI активация, которой может инактивировать потенциал-зависимые Са²⁺-каналы плазмалеммы, стимулировать Са²⁺-АТФазу саркоплазматического ретикулума  СР и снижать Са²⁺-чувствительность сократительных белков ГМК, что также может быть причиной  их релаксации [16; 19819–19825].

Список литературы:
1. Sandoo, A., Zanten, J. J., Metsios, G. S., Carroll, D., & Kitas, G. D. The Endothelium and Its Role in Regulating Vascular Tone. // The Open Cardiovascular Medicine Journal, -2010, V.4(1), -P.302-312.
2. Furchgott RF, Zawadzki JV. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. //Nature. –1980; 288: –P.373–376.
3. Vita JA, Keaney JF. Endothelial function: a barometer for cardiovascular risk?. //Circulation. –2002; –V.106: 640–642.
4. Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990.// –Nature. -1993; –V.36 2: 801–809.
5. Ross R. Atherosclerosis: an inflammatory disease. //– N.Engl. J. Med. -1999; 340: – P.1928–1929.
6. Le Brocq M, Leslie SJ, Milliken P, Megson IL. Endothelial dysfunction: from molecular mechanisms to measurement, clinical implications, and therapeutic opportunities.//- Antioxid Redox Signal. - 2008;10(9): –P.1631-74.
7. Qin CX, Chen X, Hughes RA, Williams SJ, Woodman OL. Understanding the cardioprotective effects of flavonols: discovery of relaxant flavonols without antioxidant activity.// J.Med. Chem. –2008;51(6): –P.1874-84.
8. Scholz E.P., Zitron E., Katus H.A., Karle CA.. Cardiovascular Ion Channels as a Molecular Target of Flavonoids. //– Cardiovascular Therapeutics. –2010, –V.28. –P.46–52
9. Wang G.J., Wu X. Ch., Chen Ch. F., Lin L. Ch., Huang Y.T., Shan J., Pang P. K. Vasorelaxing Action of Rutaecarpine: Effects of Rutaecarpine on Calcium Channel Activities in Vascular Endothelial and Smooth Muscle Cells // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 1999. – V.289 (3). – P.1237–1244.
10. Esimbetov А.Т., Omanturdiev S.Z., Zaripov А.А., Usmanov P.B. Characterstics of the vasorelaxant action of chrysin flavonoid on isolated thoracic rat aorta. // Science and Education in Karakalpakstan .-2019, –№3.– P.14-19.
11. Blatter LA, Wier WG. Nitric oxide decreases Ca2+i in vascular smooth muscle by inhibition of calcium current. //Cell Calcium. –1994; V.15: –P.122–131.
12. Hatanaka Y, Hobara N, Honghua J, Akiyama S, Nawa H, Kobayashi Y, et.al. Neuronal nitric-oxide synthase inhibition facilitates adrenergic neurotrans mission in rat mesenteric resistance arteries. //J.Pharmacol Exp. Ther. –2006; V.316: – P.490-497.
13. Cohen RA, Weisbrod RM, Gericke M, Yaghoubi M, Bierl C, Bolotina VM. Mechanism of nitric oxide–induced vasodilatation: refilling of intracellular stores by sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase and inhibition of store-operated Ca2+ influx. //Circ Res. –1999, –V.84 (2): –P.210-9.
14. Somlyo A.P. and Somlyo A.V. Signal transduction and regulation in smooth muscle. //Nature, –1994, –V.372,- P.231–236.
15. Feletou M, Huang Y, Vanhoutte PM. Endothelium-mediated control of vascular tone: COX-1 and COX-2 products. //Br J Pharmacol. –2011; –V.164(3): –P.894–912.
16. Yoshida Y., Sun H.T., Cai J.Q., Imai S. Cyclic GMP–dependent protein kinase stimulates the plasma membrane Ca2+ pump ATPase of vascular smooth muscle via phosphorylation of a 240–kDa protein // J. Biol. Chem.–1991.– V. 266. –P. 19819–19825.