Скрининг штаммов Aspergillus niger по биосинтезу лимонной кислоты

АННОТАЦИЯ

Изучение кислотообразующей способности (первичный скрининг) коллекционных штаммов относящихся к виду Aspergillus niger показало, что среди изученных 56 штаммов мицелиальных грибов на твёрдой питательной среде у 30 штаммов вокруг колонии не было обнаружено зоны растворения мела. Установлено, что наиболее высокой способностью образовать зоны растворения мела вокруг колонии обладали три штамма №6, №26, №29 при этом зона растворения мела составила 5,5, 5,1 и 5,8 мм (соответственно). В результате первичного скрининга было отобрано 15 штаммов мицелиальных грибов. Показано, что отобранные штаммы при культивировании на жидкой питательной среде способны синтезировать лимонную кислоту (ЛК) в количестве от 1,41 до 2,98 г/л. Максимальное значение образование ЛК отмечено у трех штаммов №6, №26 и №29, где содержание ЛК составило 2,83, 2,63 и 2,98 г/л (соответственно).

ABSTRACT

Acid-forming ability of collection’s strains (primary screening) belonging to the species Aspergillus niger has been studied. Thirty strains did not show any zones of chalk dissolution around the colonies in a solid nutrient medium among 56 strains of studied species. It was established that the 3 strains under #6, #26 and #29 had the highest ability to form chalk dissolution zones around the colony, while the chalk dissolution zones were 5.5, 5.1 and 5.8 mm, respectively. In result of the initial screening 15 strains of fungi have been selected. It was shown that the selected strains, when cultured in the liquid medium, were able to synthesize citric acid (CA) in amounts from 1.41 to 2.98 g/l. The maximum value of the CA was observed in 3 strains: #6, #26 and #29, where CA was 2.83, 2.63 and 2.98 g/l, respectively.

Ключевые слова: микробный синтез, лимонная кислота, Аspergillus niger, скрининг.

Keywords: microbial synthesis, citric acid, Aspergillus niger, screening.

Метаболиты, продуцируемые микроорганизмами, находят широкое применение в различных отраслях народного хозяйства. Важнейшая среди них является лимонная кислота (ЛК), которая применяется в пищевой, фармацевтической, легкой, электронной, радиотехнической, нефтяной и газовой промышленности [1, 2]. В настоящее время ежегодное производство ЛК составляет 1,6 млн тонн, и годовой прирост составляет 3-5% от существующего уровня [3]. Широкое применение ЛК связано с тем, что она также входит в состав моющих средств в виде ее натриевых солей, где цитрат натрия успешно заменяет триполифосфаты (ТПФ), которые являются экологически опасными. Установлено, что основной механизм действия фосфатов связан с их способностью взаимодействовать с липидно-белковыми компонентами клеточных мембран и проникновением через них в различные структурные элементы клеток. Кроме этого, загрязнение водоемов ТПФ, входящими в состав синтетических моющих средств (СМС) является основной причиной массового размножения в водоемах сине-зеленых водорослей (цианобактерий). Очень опасная, особенность цианобактерий заключается в их способности синтезировать вторичные метаболиты (циклопептиды, алкалоиды, гепатоксины, нейротоксины и др.), которые являются сильнейшими токсинами, вызывающими гибель животных и человека. Учитывая высокую гигиеническую опасность фосфатов для человека и животных мировое сообщество установило жесткие требования к содержанию фосфатов в сточных водах, питьевой воде и продуктах питания. В результате с начала 90-х годов во многих странах законодательно запретили крупнейшим компаниям производство фосфат содержащих СМС. В Японии уже к 1986 году в СМС фосфаты не применяются. В настоящее время в Германии, Италии, Австрии, Норвегии, Швейцарии и Нидерландах стирают только порошками без фосфатов. В Бельгии более 80% порошков безфосфатные, в Дании – 54%, Финляндии и Швеции – 40%, Франции – 30%, Великобритании и Испании – 25%, Греции и Португалии – 15%. Законы о запрете фосфатов в СМС действуют в Корейской Республике, на Тайване, в Гонконге, Таиланде, ЮАР. Известно, что соли лимонной кислоты (заменители триполифосфатов), являясь хорошими хелатообразователями, снижают жесткость воды и безопасны для человека и животных [4]. На сегодняшний день самым крупным производителем лимонной кислоты являются США, в частности фирмы «Ch.Pfizer» и «Miles Laboratories, Inc», которые вырабатывают ее как внутри страны, так и на своих предприятиях во многих других странах. В России в настоящее время лимонную кислоту вырабатывают в основном на Белгородском заводе «Цитробел» лимонной кислоты [2, 5]. Известно, что представители рода Aspergillus, в частности, A. niger, A. oryzae, A. flavus, A. terreus, являюся наиболее важными для коммерческого использования, так как они способны в больших количествах продуцировать широкий спектр низкомолекулярных органических кислот, в том числе лимонную кислоту [6-8]. В настоящее время в Республике Узбекистан пищевая лимонная кислота широко представлена зарубежными фирмами. Переработка местных отходов в частности мелассы и получение на её основе лимонную кислоту способствует частично или полностью заменить импортируемое сырье. В настоящее время в Институте микробиологии АН РУз в лаборатории «Коллекции микроорганизмов» поддерживается большая коллекция местных штаммов относящийся к виду A. niger, которые были выделены из различных субстратов нашего региона. Получение местного активного штамма – продуцента лимонной кислоты в дальнейшем будет способствовать использованию и переработки местного отхода сахарного производства – меласса.

Цель данной работы – скрининг коллекционных штаммов мицелиальных грибов относящийся к виду Aspergillus niger по биосинтезу лимонной кислоты.

Объектом исследования служили 56 штаммов мицелиальных грибов относящихся к виду A. niger которые были получены из лаборатории «Коллекции микроорганизмов» Института микробиологии АН РУз и поддерживались на среде Чапека следующего состава (г/л): Сахароза – 20; NaNO₃- 2; KH₂PO₄-1; MgSO₄*7H₂O-0.5; KCL-0.5; FeSO₄*7H₂O; Агар – 15 рН=6.5. Способность коллекционных штаммов относящихся к виду A. niger синтезировать кислоты (первичный отбор) оценивали на агаризованной среде Чапека с содержанием CaCO₃ – 6 г/л и другими компонентами [9]. Следует отметить, что коллекционные штаммы были способны расти и развиваться на среде с сахарозой в концентрации не более 20 г/л, в связи с этим первичный отбор коллекционных штаммов проводили на среде содержащий 20 г/л сахарозы. Следует отметить, что концентрация других использованных компонентов были аналогичными, как представлено в патентной заявке [9]. Культивирование мицеллиальных грибов проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, содержащих 70 мл питательной среды Чапека. Для инокуляции среды использовали суспензию спор мицелиальных грибов с содержанием 10⁶ спор/мл. Продолжительность культивирование осуществляли в течение 96 часов, при температуре 28⁰С. По окончании культивирования колбы с глубинной культурой гриба предварительно нагревали на водяной бане при 80⁰С в течении 45 мин для инактивации мицелия грибов. Затем колбы охлаждали до комнатной температуры, отделяли мицелий грибов от культуральной жидкости фильтрованием, затем определяли содержание биомассы. Для определения биомассы мицелиальных грибов использовали весовой метод. Определение рН культуральной жидкости определяли потенциометрическим методом. Содержание сахарозы в растворах определяли на спектрофотометре UV-5100, при длине волны 490 нм в кювете с толщиной 10 мм [10]. Количество титруемых органических кислот (общей кислотности) определяли по методу Ермакову [11]. Количественное содержание ЛК определяли химическим способом по методу Жаболовской Н.А с соавторами [12]. Количество ЛК в анализируемой пробе определяли по соответствующей калибровочной кривой. На первом этапе работы для оценки кислотообразующей способности микроскопических грибов был использован качественный скрининг (первичный отбор) штаммов. Оценка кислотообразующей способности проводилась на агаризованной питательной среде с мелом. По зонам растворения мела вокруг колонии, которая образуется, за счёт выделения органических кислот устанавливалось, кислотообразование. Скрининг коллекционных штаммов относящихся к виду A. niger по кислотообразующей способности показало, что среди 56 штаммов микроскопических грибов 30 штаммов не проявляли зону растворения мела на твёрдой питательной среде (Рисунок.1). Одиннадцать штаммов №3, №9, №11, № 489, №491, №492, №602, №604, №620, № 624, № 789 имели зону растворения мела от 1 мм до 3 мм, три штамма №14, №17, №493 имели зону растворения мела равную 3 мм. У девяти штаммов №1, №8, №23, №24, №30, №597, №601, №618, №788 зона растворения мела варьировала от 3.5 до 4,2 мм. Исследование показало, что наиболее высокое экскреция кислот наблюдалась у трех штаммов №6, №26, №29, где зона растворения мела составила 5,5, 5,1 и 5,8 мм (соответственно). Следует отметить, что штамм №6 был выделен из плодов чеснока Ташкентской области, штамм №26 был изолирован из почвы Ферганской области и штамм № 29 был выделен из почвы Бухарской области. В результате скрининга на среде с мелом было отобрано 15 штаммов коллекционных культур микроскопических грибов. Варианты образующие небольшие зоны растворения мела (менее 3 мм) исключили из дальнейших исследований как слабые кислотообразователи. Следует отметить, что тестом на агаризованной среде на кислотообразующую способность штаммов невозможно точно оценить уровень синтеза ЛК в среде. С целью количественного определения ЛК, а также для проверки результатов, полученным методом селекции на твердой среде, проводили культивирование отобранных штаммов в жидкой питательной среде Чапека. К ультивирование микроскопических грибов проводили на питательной среде с начальной величиной рН 6,0. Величина рН является важным условием среды, оказывающим большое влияние на интенсивность образования конечных продуктов превращения источников углерода и энергии. От величины рН зависит состояние ионогенных групп на поверхности клеток, а если ионы Н⁺ и ОН^- проникают внутрь, то и на внутренних структурах клетки. Под влиянием рН может изменяться активность внутриклеточных ферментов, интенсивность конструктивного и энергетического обмена микроорганизмов [2].

Результаты исследований по изменению рН среды в процессе культивирования показало, что через 72 ч у штаммов №6, №17, №26, №29, №788 наблюдалось подкисление среды в 1,4 раза ниже по сравнению с исходным значением рН 6,0. (Таблица 1).

Таблица 1.

Биосинтез лимонный кислоты коллекционными штаммами относящихся к виду Aspergillus niger

На 96 ч культивирования наиболее интенсивное снижение рН среды было обнаружено у четырех штаммов №6, №26, №29 и №788, за этот период рН среды снизился от 6,0 до 3,87; 3,95; 3,78 и 3,94 (соответственно). Исследования показали, что среди изученных штаммов наиболее высокое накопление биомассы наблюдалось у 5 штаммов №6, №17, №26, №29 и №788, высокое накопление биомассы этих штаммов сопровождалось интенсивным накоплением органических кислот. При этом содержание органических кислот этих штаммов варьировало от 3,65 до 3,90 г/л. Исследования показали, что интенсивное накопление органических кислот не всегда сопровождается высоким содержанием образования ЛК в среде культивирования. Показано, что отобранные штаммы при культивировании на жидкой питательной среде способны синтезировать ЛК в количестве от 1,41 до 2,98 г/л. Более высокое значение образование ЛК отмечено у трех штаммов №6, №26 и №29, где содержание ЛК составило 2,83, 2,63 и 2,98 г/л (соответственно).

Таким образом, изучение кислотообразующей способности (первичный отбор) коллекционных штаммов относящихся к виду A. niger показало, что среди 56 штаммов мицелиальных грибов у 30 штаммов зона растворения мела вокруг колонии на твёрдой питательной среде не было обнаружена. У девяти штаммов зона растворения мела варьировала от 3.5 до 4,2 мм. Установлено, что наиболее высокой способностью образовать зоны растворения мела вокруг колонии обладали три штамм №6, №26, №29, где зона растворения мела составила 5,5, 5,1 и 5,8 мм (соответственно). Показано, что отобранные штаммы (15 штаммов) при культивировании на жидкой питательной среде способны синтезировать ЛК в количестве от 1,41 до 2,98 г/л. Максимальное значение образование ЛК отмечено у трех штаммов №6, №26 и №29, где содержание ЛК составило 2,83, 2,63 и 2,98 г/л (соответственно).

Список литературы:
1. Никифорова Т.А. Теоретические и практические аспекты микробиологического производства лимонной кислоты: диссертация в форме научного доклада на соискание ученой степени доктора технических наук: – Санкт-Петербург. – 1999. – С. 3.
2. Авчиева П.Б. Направленный биосинтез лимонной кислоты при периодической и непрерывной ферментации гриба Aspergillus niger: диссертация на соискание ученой степени доктора технических наук: – М. –1997. – С. 6 - 7.
3. Soccol C.R., Vandenberghel P.S., Rodrigues C., Pandey A. New perspectives for citric acid production and application // Food. Technol. and Biotechnology. – 2006. – V. 44. – P. 141 - 149.
4. Финогенова Т.В., Моргунов И.Г, Лауринавичюс К.С., Мельников В.А. Загрязнение полифосфатами как причина массового размножения цианобактерий в водоемах // Вода: химия и экология. – 2009. – №3. – С. 30-35.
5. Прахова М.С., Выборнова Т.В., Шарова Н.Ю. Биосинтез лимонной и глюконовой кислот микромицетом Aspergillus niger // Сборник: Научное обеспечение инновационных технологий производства и хранения сельскохозяйственной и пищевой продукции. – 2014. – С. 94-98.
6. Bentley R. A., Bennett J.W. Ferment of Fermentations: Ref lections on the Production of Commodity Chemicals Using Microorganisms // Advan. Appl. Microbiol. – 2008. – V. 63(7). – P. 1- 32.
7. Scazzocchio C. Aspergillus: A. multifaceted Genus: Encyclopedia of Microbiology. – Boston: Academic Press Inc. – 2009. – P. 401- 421.
8. Plassard C., Fransson P. Regulation of low molecular weight organic acid production in fungi // Fungal Biol. Rev. Elsevier Ltd. – 2009. – V. 23 (1, 2). – P. 30 - 39.
9. Патентная заявка РУз №IAP 20190069. Экспресс-способ для первичного отбора кислотообразующих мицелиальных грибов // Пулатова О.М., Алимова Б.Х., Махсумханов А.А., Ташбаев Ш.А., Камбаралиева М.И., Холмурадова Н.К. – 2019.
10. Злобин А.А. Выделение лимонной кислоты из культуральной жидкости Аspergillus niger: Лабораторный практикум по «Основам биотехнологии». –Киров. – 2014. – С. 7-8.
11. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Ярош Н.П., Перуанский Ю.В., Луковникова Г.А., Иконнокова М.И. // Методы биохимического исследования растений. Под ред. А.И. Ермакова. – 3-е изд. – Л. Агропромиздат. Ленинградское. Отд., –1987. – С. 430.
12. Жаболовская Н.А., Агеев Л.М., Петрова Л.Ф. Сравнительная оценка методов количественного определения лимонной кислоты // Хлебопекарная и кондитерская промышленность. – 1968. –№ 5. – С. 22-24.