Влияние пестицидов на микробиоценозы и ферментативную активность сероземов

АННОТАЦИЯ

Проведен анализ микробиологической и ферментативной активности почв, загрязненных пестицидами. В модельных испытаниях показано, что применение шлама биогазовой установки, Azotobacter sp., Pseudomonas stutzeri способствует деструкции смеси ДДЭ и ДДТ. Проведенный анализ ферментативной активности модельных опытов выявил корреляцию между деструкцией пестицидов и ферментативной активностью почв. С уменьшением концентрации пестицидов увеличивается ферментативная активность почв.

ABSTRACT

Analysis of microbiological and enzymatic activity of soils polluted with pesticides was conducted. Model trials revealed that joint application of sludge of biogas unit, Azotobacter sp. and Pseudomonas stutzeri promotes to destruction of the DDE and DDT mixture. Conducted analysis of enzymatic activity of the model trials revealed correlation between pesticides’ destruction and enzymatic activity of soil. The enzymatic activity of soil increased with lowering pesticides’ concentration.

Ключевые слова: пестициды, деградация, Bacillus, Pseudomonas, шлам биогазовой установки, ферментативная активность почв.

Keywords: pesticides, degradation, Bacillus, Pseudomonas, sludge of biogas unit, enzymatic activity of soil.

Введение

Как известно, на сегодняшний день пестициды широко используются в мире несмотря на то, что их использование нарушает микробный баланс почвы, загрязняет атмосферу и водные системы. Наиболее известный пестицид ДДТ повсеместно применяемый в 20 веке, остаточные концентрации которого до сих пор загрязняют почву, обладает значительной устойчивостью к разложению. Никакие физические факторы не способны сильно повлиять на процесс разложения ДДТ. В настоящее время ДДТ запрещен для использования [1], однако, многолетнее применение его во все возрастающих масштабах привело к значительному накоплению во внешней среде, почве, воде.

Необходимость исследования взаимодействия пестицидов с почвенной микрофлорой обусловлена важнейшей ролью микроорганизмов в создании почвенного плодородия и детоксикации почвы от ксенобиотиков [2]. Главную пестицидную нагрузку в почве берут на себя микроорганизмы, которые, благодаря своему видовому разнообразию и ферментативному аппарату, способны частично или полностью утилизировать химические средства защиты растений. Как известно, пестициды снижают микробиологическую активность почвы, тем самым увеличивая токсическое действие, в результате чего нагрузка на почвенные микроорганизмы при разложении химических веществ многократно усиливается. Многочисленными исследованиями показано, что пестициды в различных концентрациях могут подавлять рост отдельных групп микроорганизмов, либо стимулировать их развитие [3-7]. В работах Бабкиной Э.И. [8], Ксенофонтовой О.Ю. [9], установлено, что естественные процессы самоочищения почв не способны справиться с нынешними объемами загрязнений.

В связи с этим, одной из актуальных задач современной биотехнологии является создание биопрепаратов на основе штаммов-деструкторов, полученных из аборигенной микрофлоры, для решения комплекса задач, связанных с реабилитацией почв, загрязненных ксенобиотикам. На настоящий момент выделено и депонировано большое количество штаммов-деструкторов пестицидов, как в виде монокультур, так и в консорциумах. Основную группу почвенных микроорганизмов, разрушающих ксенобиотики, составляют бактерии рода Pseudomonas, способные расщеплять более 100 органических соединений. Многие бактерии рода Pseudomonas несут плазмиды, кодирующие ферменты, которые катализируют расщепление ароматических и галогенсодержащих органических соединений [10,11], которые также встречаются у микроорганизмы рода Bacillus, таких, как Bacillus pumilus Bacillus sp. [12-15]. Из азотфиксирующих микроорганизмов чаще всего идентифицировались Azomonas agilis и Azotobacter chroococcum [16,17]. Применение диазотрофов способствует не только деструкции пестицидов, но и обогащает почву усвояемым азотом.

Объекты и методы исследования

Объектом исследования служили образцы сероземных почв с территории опытного участка. Отбор проб почвы осуществляли по принципу «конверта» в стерильный пакет. Средний образец почвы массой 2.5 кг доставляли в лабораторию, где помещали в четыре пластмассовых сосуда и вносили экспериментальные дозы пестицида. Почву по килограмму вносили в емкость в стерильном и нестерильном виде. Исследование проводили с исходной почвой и с микроорганизмами в течение 60 дней.

Для оценки влияния пестицидов на микробный комплекс почвы сравнивали численность и структуру комплексов бактерий. Для определения численности и выделения микроорганизмов из почвы использовали методы посева на агаризованные питательные среды из разведений почвенных суспензий [18]. Структуру комплекса бактерий характеризовали с использованием физиолого-биохимических и морфологических показателей отдельных культур [19]. Материалом исследований явились пестициды ДДТ и ДДЭ, микроорганизмы, выделенные из почв Южного Приаралья и шлам биогазовой установки. Для определения микробиологической активности был проведен анализ их развития на следующих средах: Мясо-пептонный агар, Эшби, Гильтай, среда Чапека и среда Виноградского. Кислотность определяли на рН метре Меттлер Толедо. Определение ферментативной активности почв проводили по общепринятым методикам [19]. Агрохимический анализ провели на базе лабораторий Узгидромета.

Результаты исследований.

В результате изучения в исходной почве состава автохтонной микробиоты были выделены основные группы микроорганизмов, участвующие в почвообразовательном процессе, и определены их количественные показатели (табл.1).

Таблица 1.

Микробиологический анализ исходной пробы почвы для модельных опытов

Как видно из таблицы 1, анализ развития различных физиологических групп микроорганизмов выявил наличие характерных для сероземов бактерий. Выявляются аммонификаторы, денитрификаторы и нитрификаторы, а также микроскопические грибы. Также в достаточном количестве выявляются органотрофы, среди которых превалируют спороносные микроорганизмы.

Дальнейшие работы по проведению модельных испытаний укладывались в общую схему характерную для испытаний. Была подготовлена почва, отобранная с опытного участка и поделена пополам. Одна часть была простерилизована. Затем в почву внесен дуст как в стерильную, так и в нестерильную. Почва была увлажнена и в каждый опытный образец вносилась суспензия отобранных микроорганизмов и жидкий шлам биогазовой установки из расчета 10% (рис.1).

Рисунок 1. Модельные опыты по деструкции пестицидов

Анализ разложения пестицидов представлен через 60 суток на рис. 2-3. Исследование проводили с различными штаммами микроорганизмов. Инокуляция загрязненной почвы Bacillus sp. №2, Bacillus sp. №17, Azotobacter, Pseudomonas stutzeri и шлам биогазовой установки.

Рисунок 2. Нестерильная почва через 60 суток

Рисунок 3. Стерильная почва через 60 суток

Анализ результатов по изменению содержания пестицидов показывает, что в нестерильной почве заметно снижается концентрация пестицидов (рис. 3) как в контрольной почве, так и в опытных образцах. Очевидно, что этот эффект в первую очередь свидетельствует о роли аборигенной микрофлоры, количество которой в исходной почве соответствует экологическому уровню и в комплексе с внесенными деструкторами она способствовала интенсивному разложению ДДТ в почве.

Развитие микроорганизмов и микробных комплексов в стерильной почве показывает конкретную роль каждого микроорганизма. Следует отметить, что интенсивно шло разложение ДДТ (исходное 8 мг/кг почвы) гораздо менее труднодоступным субстратом оказалось наличие ДДЭ (исходное 20 мг/кг почвы) как в стерильной почве, так и природной среде.

Важным показателем для разрушения пестицидов является ферментативная активность почвы, т.к. активность почвенных ферментов изменяется в ответ на попадание в почву пестицидов и других техногенных химических соединений. В наших модельных испытаниях определяли активность полифенолоксидазы и пероксидазы, так как им в почвах принадлежит важная роль в процессах гумусообразования. Полифенолоксидаза катализирует окисление полифенолов, фенолов, которыми так богаты пестициды в хиноны в присутствии свободного кислорода воздуха. Пероксидаза же катализирует окисление полифенолов в присутствии перекиси водорода или органических перекисей. Биокаталитическая активность почв находится в значительном соответствии со степенью обогащенности их микроорганизмами и зависит от типа почв и изменяется по генетическим горизонтам. Активность биокаталитических реакций почв изменяется в течение года. Наименьшая она весной и осенью, а наиболее высокая обычно в июле-августе, что соответствует динамике общего хода биологических процессов в почвах. Однако в зависимости от типа почв и их географического положения динамика ферментативных процессов весьма различна.

Проведенный нами анализ ферментативной активности модельных опытов показал, что наблюдается корреляция между деструкцией пестицидов и ферментативной активностью - уменьшение концентрации пестицидов увеличивает ферметативную активность (табл.2).

Таблица 2.

Ферментативная активность почвы

Заключение

Анализируя полученные результаты можно сделать вывод, что все культуры, отобранные нами для проведения модельных испытаний способны к деструкции смеси ДДЭ и ДДТ. Однако, лучшие результаты показали шлам биогазовой установки, бинарная культура и Pseudomonas stutzeri, неплохие результаты и у остальных микроорганизмов. При участии микроорганизмов и их ферментов в почве и воде происходят процессы гидролиза, окисления и восстановления пестицидов [2,20,21]. Проблема детоксикации старых пестицидов и продуктов их деструкции, а также исследования по влиянию новых поколений пестицидов на почвенную микробиоту для оценки степени их безопасности по-прежнему входят в число первоочередных задач биомониторинга.

Изучение развития микробиоты установило, что в природной почве активно развивается спонтанная или аборигенная микрофлора, что несколько затормаживает процесс деструкции.

Также важно отметить, что ферментативная активность почвы является нестабильным параметром в естественных условиях, и зависит как от изменения внешних факторов (температура, влажность), так и от количественного содержания в ней токсичных веществ, таких как пестициды.

Список литературы:
1. Стокгольмская конвенция о стойких органических загрязнителях. UNEP Chemicals. - 2002. - 53 с.
2. Круглов Ю.В. Микрофлора почвы и пестициды. - М.: Агропромиздат. - 1991.- 128 с.
3. Олискевич В.В., Талаловская М., Третьякова С.Э. Оптимизация технологий биоремедиации сельскохозяйственных земель, загрязненных гербицидом «Гезагард» // Известия Саратовского университета. - Серия “Химия. Биология. Экология”. - 2013. - Вып.2. - Т.13. - С. 101-107.
4. Арипов Т.Ф., Ташпулатов Ж.Ж., Зайнитдинова Л.И., Куканова С.И. Микроорганизмы зон пестицидного загрязнения // Биотехнология состояние и перспективы развития: тез. докл. VIII Московского международного конгресса. – М. – Россия. - 2015. - часть 2. - с.394-395.
5. Зайнитдинова Л.И., Куканова С.И., Ташпулатов Ж.Ж. Микробиота районов Южного Приаралья. // Science and world. (International scientific journal, Russia). 2016. - №9 (37). - Vol.1. - p. 64-66.
6. Fenner K., Canonica S., Wackett L.P., Elsner M. Evaluating pesticide degradation in the environment: blind spots and emerging opportunities. // Science 2013. - 341:752–758.
7. Jacobsen C.S., Hjelmsø M.H. Agricultural soils, pesticides and microbial diversity. //Curr. Opin. - 2014. - Biotech. 27. - 15–20 10.1016/j.
8. Бабкина Э.И., Сурин В.А., Самсонов Д.П. Полигоны захоронения пестицидов как источник загрязнения окружающей среды // Природные ресурсы. Использование и охрана природных ресурсов в России. – 2003. Бюл. № 11–12. С. 115-122.
9. Ксенофонтова О.Ю. «Микроорганизмы почвы и пестициды». LAP LAMBERT Academic Publishing. – 2015. - 01-16. 136 с.
10. Satish G., Parte1 3., Ashokrao D. Mohekar and Arun S. Kharat *Microbial degradation of pesticide: A reviewArticle // African journal of microbiology research. - 11(24):992-1012 - June 2017.
11. Parte S., Rokade K., Mali G., Kudale S. Biodegradation of sufonated aromatic amine by Pseudomonas demolyticum NCIM2112. - Chem. Pharm. Res. -2013. -5(4):335-339.
12. Gilani R.A., Rafique M., Rehman A., Munis M.F., Rehman S.U., Chaudhary H.J. Biodegradation of chlorpyrifos by bacterial genus Pseudomonas // J. Basic Microbiol. - 2016. - 56(2):105-19. DOI: 10.1002/jobm.201500336
13. Кочетков В.В., Балакшина В.В., Мордухова Е.А, Боронин А.М. Плазмиды биодеградаии нафталина в ризосферных бактериях рода Pseudomonas // Микробиология - 1997. - Т. 66. - №2. - С. 211-216.
14. Anwar S., Liaquat F., Khan Q.M., Khalid Z.M., Iqbal S. Biodegradation of chlorpyrifos and its hydrolysis product 3,5,6-trichloro-2-pyridinol by Bacillus pumilus strain C2A1. // J. Hazard. Mater. - 2009. - 168:400-405.
15. Batisson I., Crouzet O., Besse-Hoggan P., Sancelme M., Mangot J.F., Mallet C., Bohatier J. Isolation and characterization of mesotrione-degrading Bacillus sp. from soil. // Environ. Pollut. - 2009. - 157:1195-1201.
16. Chennappa G., Adkar-Purushothama C.R., Naik M.K., Suraj U., Sreenivasa M.Y. Impact of Pesticides on PGPR Activity of Azotobacter sp. Isolated from Pesticide Flooded Paddy Soils Greener // Journal of Agricultural Sciences. – 2012. - 6.15. - Vol. 4 (4). - pp. 117-129.
17. Kadam T. Degradation of phorate by Azotobacter isolates // Bull Environ Contam. Toxicol. – 2012. - p 156-171.
18. Нетрусов А.И., Егоров М.А., Захарчук Л.М. Практикум по микробиологии // – М.: Академия. - 2005. – С. 96-242.
19. Звягинцев Д.Г. Биологическая активность почв и шкалы для оценки некоторых её показателей // Почвоведение. – 1978. - № 6. - С. 48-54.
20. Добровольский Г.В., Никитин Е.Д. Сохранение почв как незаменимого компонента биосферы - М.: Наука. - МАИК «Наука/Интерпериодика». - 2000. - 185 с.
21. Ашихмина Т.Я., Домрачева Л.И., Огородникова С.Ю., Олькова А.С., Кантор Г.Я., Кондакова Л.В. Изучение воздействия фосфорсодержащих поллютантов на почвенные микроорганизмы // Рос. Химический журн. - 2010. - Т. LIV. - No 4. - С.183 – 186.