Получение компонентов для раневых покрытий и оценка их биологической активности

АННОТАЦИЯ

Доминирующей тенденцией современных раневых покрытий является использование композиционных полимерных матриксов на основе биосовместимых, биодеградируемых природных полимеров с добавлением биологически активных соединений. В качестве полимерной основы для раневого покрытия нами выбран коллаген, который мы выделяли из сухожилий хвостов млекопитающих, в качестве биологически активных компонентов были протестированы алкалоиды, выделенные из растения рода Convolvulus. Изучена антимикробная и пролиферативная активность алкалоидов, выделенных из растений рода Convolvulus, а также токсичность данных соединений. Установлено, что 5% раствор конвольвина и конволамина эффективен против широкого спектра стафилакоковов, кишечной палочки и грибов рода Candida, а алкалоид филлальбин вызывает пролиферацию клеток кожи фибробластов в концентрации 10 мкг/мл и при этом тормозит рост грибов рода Candida. Кроме того для данных соединений установлены показатели IC₅₀ и LD₅₀. На основе очищенного коллагена с добавлением различных концентраций алкалоидов созданы раневые покрытия в виде тонких плёнок для дальнейших доклинических исследований и анализа их ранозаживляющих свойств.

ABSTRACT

The dominant trend in modern wound dressing is the use of composite polymer matrices based on biocompatible, biodegradable natural polymers with the addition of biologically active compounds. As a polymer base for wound dressing, we selected collagen, which we isolated from the tendons of mammalian tails, and alkaloids isolated from a plant of the genus Convolvulus were tested as biologically active components. The antimicrobial and proliferative activity of alkaloids isolated from plants of the genus Convolvulus, as well as the toxicity of these compounds, were studied. It was found that a 5% solution of convolvin and convolamine is effective against a wide range of staphylococci, Escherichia coli and Candida fungi, and the phyllalbine alkaloid causes proliferation of fibroblast skin cells at a concentration of 10 μg / ml and inhibits the growth of Candida fungi. In addition, IC₅₀ and LD₅₀ are established for these compounds. Based on purified collagen with the addition of various concentrations of alkaloids, wound coatings in the form of thin films were created for further preclinical studies and analysis of their wound healing properties.

Ключевые слова: раневое покрытие, филлальбин, конвольвин, антимикробная активность, цитотоксичность, пролиферативная активность, токсичность.

Keywords: wound cover, phyllalbin, convolvin, antimicrobial activity, cytotoxicity, proliferative activity, toxicity.

Лечение ран и ожогов, уход за повреждениями кожи, слизистых оболочек и хирургическими швами на протяжении многих веков является одной из важных проблем в медицине.

В комплексном подходе к проблеме местного лечения ран и ожогов одно из главных мест отводится лечению с использованием раневых покрытий (РП). Наиболее эффективными являются биологически активные РП, обладающие необходимыми свойствами для нормального течения раневого процесса с учетом стадии, с дополнительным лечебным действием введенных в них биологически активными веществами БАВ [7, 8]. На сегодняшний день ассортимент РП заметно вырос и составляет более 300 разновидностей [2, 3, 4,10], но ни одно из известных РП не соответствует всем требованиям предъявляемым к повязкам. Указанные повязки и композиции неспособны предупредить вторичные деструктивные явления и раневые осложнения, связанные с накоплением в ране агрессивных продуктов обмена: свободных радикалов, протеолитических ферментов, которые вызывают вторичное повреждение тканей и приводят к более медленному заживлению ран. Их недостатком является также то, что они воздействуют лишь на отдельные звенья патогенеза раневого процесса.

В этой связи остаётся актуальным поиск и создание новых композиций РП. В данном научном исследовании проведена оценка и отбор биологически активных компонентов для создания композиций РП на основе коллагена.

Материалы и методы исследования. Экспериментальные исследования проведены с соблюдением правил, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или иных научных целей (ETS N 123), Страсбург, 18.03.1986г. Полученные результаты подвергали статистической обработке с использованием стандартного пакета программ Statistika for Windows по общеизвестным методам вариационной статистики с оценкой значимости показателей (M±m) и различий рассматриваемых выборок по t-критерию Стьюдента. Различия в сравниваемых группах считались достоверными при уровне значимости 95% (p<0,05) [9].

В работе использовались белые беспородные мыши массой 15-20г., крысы массой 150-180г.

Получение основы для раневых покрытий. В качестве основы для раневых покрытий был выбран коллаген. Для получения коллагена из свежих хвостов крыс и крупного рогатого скота извлекали сухожилия. Сухожилия расщепляли на нити и измельчали и опускали в колбу с 0,1%-ного раствором ледяной уксусной кислоты и оставляли в холодильнике на 48 ч. Затем содержимое колбы центрифугировали (6000 об/мин в течение 1 ч) и осадок опять разводили 0,1%-ного раствором уксусной кислоты (3:1), через 24 ч. центрифугировали, надосадок сливали, а гелеобразный осадок хранили в холодильнике. Перед использованием раствор коллагена подвергали диализу против дис. воды. Диализованный раствор коллагена наносили по 10 мл. на чашки Петри (диаметром 90 мм). Коллагеновые пленки уплотняли парами аммиака. Через 2 - 5 мин коллаген полимеризовался до тонкой пленки. Перед полимеризацией в коллаген можно вносить биологически активные вещества (БАВ), создавая различные композиции раневых покрытий. В наших исследованиях в качестве БАВ были отобраны алкалоиды с антимикробной, цитотоксической и пролиферативной активностью.

Получение биологически активных компонентов РП – алкалоидов. Для выделения и очистки сумм алкалоидов и индивидуальных соединений из растений рода Сonvolvulus воздушно-сухое сырьё – надземной части растения Сonvolvulus krauseanus, измельчено и проведена восьмикратная экстракция основных смесей алкалоидов 85%-ным этанолом. Спиртовые извлечения объединено, сгущено до водного остатка и подкислено 5%-ным раствором серной кислоты до рН 3-4. Кислые извлечения промыты бензином и подщелочены концентрированным раствором аммиака до рН 10-11. Алкалоиды извлечены хлороформом до отрицательной реакции на алкалоиды. Хлороформные извлечения осушены безводным Na₂SO₄, профильтрованы и отгнан растворитель. Хлороформные суммы алкалоидов в круглодонной колбе обработаны экстракционным бензином при нагревании на водяной бане с обратным холодильником. Объединённые бензиновые растворы алкалоидов сгущены, осушены досуха под вакуумом в результате чего получена смесь алкалоидов конвольвина и конволамина.

Для получения филлальбина 1 кг воздушно-сухого сырья Convolvulus subhirsutus измельчены, смочены 5%-ным раствором аммиака и загружены в перколятор ёмкостью 5 литров. Через 2 часа залиты хлороформом в соотношении 1:5. Через сутки хлороформное извлечение слито, а процедура повторена 6 раз. Объединённые и сгущённые хлороформные извлечения исчерпывающе обработаны 10%-ным раствором серной кислоты. Объединённый кислый раствор промыт экстракционным бензином, подщелачен концентрированным раствором аммиака, после чего алкалоид извлечён хлороформом до отрицательной реакции на алкалоиды. Растворитель отогнан и получена сумма алкалоидов.Полученная вышеописанным методом хлороформная сумма алкалоидов обработана экстракционным бензином при нагревании на водяной бане. Остаток суммы алкалоидов растворен в ацетоне, который извлекает филлальбин.

Изучение острой токсичности РП и компонентов РП. Изучение острой токсичности компонентов РП проводили на половозрелых белых крысах-самцах с исходной массой тела 138-160 гр. Экспериментальные группы были сформулированы по 6 штук в каждой. Компоненты РП разводили до получения основных разведений – 200 мг/кг, вначале 96⁰ этиловым спиртом, а затем –двукратные разведения в физрастворе и получали таким образом следующие концентрации алкалоидов: 100-50-25-12,5-6,25-3,12 мг/кг, которые вводили однократно внутривенно (в/в) и подкожно (п/к). Спустя 3-4 часа после введения компонентов животным давали натуральные и брикетные корма. Наблюдение за экспериментальными животными проводилось на протяжении 14 суток.

Изучение хронической токсичности РП и компонентов РП. Опыты проводили на белых беспородных крысах – самках массой 150-160г. Растворы компонентов РП вводили в желудки крыс ежедневно в дозах 5-10-50 мг/кг в течение одного месяца. Каждую дозу испытывали на шести крысах. Контрольной группе животных в аналогичных условиях вводили воду. Все подопытные и контрольные животные находились в одинаковых условиях и на обычном рационе. На протяжении всего опыта животные находились под ежедневным наблюдением; регистрировали общее состояние, поведение, потребление корма и воды, состояние волосяных покровов и слизистых оболочек. После последнего введения алкалоидов у всех групп животных из хвостовой вены, путём частичной резекции (0,5- 1,0 см), были взяты аликвоты крови для определения развернутых показателей на гематологическом анализаторе ВС-3000 (Mindray, P.R.China). Затем под легким эфирным наркозам у животных, путем одномоментной декапитации, собирали кровь для биохимических исследований.

Изучение биохимических показателей крови экспериментальных животных. Биохимические показатели сыворотки крови определяли унифицированными методами: общий белок – биуретовым, аспартат-аминотрансферазу (АСаТ) и аланинаминотрансферазу (АЛаТ) – унифицированным методом Райтмана-Франкеля, щелочную фосфатазу – унифицированным методом с нитрофенилфосфатом, γ-гамма-глутамил-трансферазу с γ-гамма-глутамил-п-нитроанилидом, холестерин-энзиматически колориметрическим методом, общий белок – колориметрическим биуретовым методом (наборы реактивов фирмы CYPRESS Diagnostics, Бельгия и Human, Германия) на биохимическом анализаторе ВА-88 А (Mindray, P.R.China).

Изучение кожно-раздражающего действия РП. Изучение кожно-раздражающего действия РП производиласьв соответствии с ГОСТ ISO10993-11-2011. На выстриженный участок кожи спинки животных площадью 15х10 см аппликацию исследуемого вещества в виде геля наносили на участок размером 2х2 см. Животных фиксировали в течение 4-х часов. Реакция кожи регистрировалась по окончании экспозиции через 1 и 16 часов после аппликации. Реакцию кожи учитывали по шкале кожных проб в баллах по показателям реакции кожных покровов.

Изучение местно-раздражающее действие на глаза (нативного средства и рабочих концентраций). Местно-раздражающее действие на глаза препаратов оценивали на кроликах. Отмечали выраженность гиперемии и отека конъюнктивы, инъекцию сосудов склеры, состояние роговицы и радужной оболочки, количество и качество выделений из глаза.

Получение культуры клеток фибробластов для скрининга веществ на цитотоксичность. Забор образцов кожи у животных осуществляли после забоя с выбритого места. Образцы ткани помещали во флаконы с средой ДМЕМ, содержащей антибиотики гентамицин (50 мкг/мл) и амфотерицин Б (10 мкг/мл) и 2мМ раствора глутамина и хранили не дольше 4 часов при + 40⁰С. Экспланты размером 2-5 мм² дермой вниз помещали в 50 см² культуральные флаконы. После закрепления эксплантов в каждый культуральный флакон добавляли по 2 мл ростовой среды DMEM/F-12, содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров - FBS и 1% раствор антибиотика-антимикотика. Инкубацию проводили в С0₂-инкубаторе при 37°С и 5% С0₂ в течение суток. Через 2 суток заменяли среду по 4 мл в каждый культуральный флакон. Пролиферацию клеток наблюдали на 2-3 день инкубации, монослой клеток формировался на 7-20 день. Далее производили пассаж клеток и субкультивирование [5].

Получение первичной культуры клеток гепатоцитов. Для получения первичной культуры гепатоцитов печень крысы извлекали в стерильных условиях, измельчали и аккуратно гомогенизировали, стараясь не разрушить клеточную стенку. Далее в гомогенат добавляли стерильный 0,9% раствор NaCl и центрифугировали при 800 об/мин. Осадок ресуспендировали в ростовой среде ДМЕМ, содержащей 10% FBS, 1% раствора антибиотика-антимикотика и 2 мМ раствора глутамина. Клетки культивировали в 96-луночных планшетах в С0₂-инкубаторе при 37°С, 5% С0₂ и 80%-ной влажности [6].

Тест с нейтральным красным. Для анализа клетки высевают в 96-луночные планшеты. По истечении 24 ч питательную среду заменяют средой, содержащей определенное количество тестируемых образцов и контролей, и инкубируют в С0₂-инкубаторе 72 часа. Далее планшеты отмывают дважды 1*PBS и инкубируют в свежеприготовленном растворе нейтрального-красного в среде ДМЕМ (3,3 мкг/мл) в С0₂-инкубаторе в течение 3 ч. После удаления супернатанта и тщательного промывания лунок раствором 1^хPBS, в лунки вносят органический растворитель - кислый этанол по 100 мкл/лунку, встряхивая в течение 45 мин. Поглощение определяют при длине волны 540 нм. Контролем служат интактные клетки, оптическая плотность (ОП) которых принимается за 100%-ную выживаемость клеток. Жизнеспособность клеток определяют, как отношение (в процентах) абсорбции интактных клеток от неинтактных. Все эксперименты выполняют трижды для каждого вещества и концентрации, анализируют, статистически обрабатывают, и при необходимости повторяют.

Концентрация исследуемого соединения, которая вызывает 50%-ную гибель клеток (IC₅₀) может быть рассчитана графически по дозозависимой кривой [1].

Определение противомикробной активности агар-диффузионным методом. Суспензию бактериальных клеток подготавливали из суточной субкультуры соответствующего штамма, с 1×10⁶ колоний в 1 мл. Стерильный питательный агар (Immunpräparate, Berlin, D, 25 г агар/л дис. вода) инокулировали бактериальными клетками (200 мкл бактериальных клеток в 2 мл 0.9% NaCl суспензии и в 20 мл среды) и вносили в чашки Петри для получения твердой фазы. Candida albicans (1×10⁵ КОЕ/мл) была инокулирована в стерильный Mueller-Hinton-агар (BectonDickinson, Heidelberg) в соответствии с ГФ (XI выпуск) и DIN E 58940-3 для агар диск-диффузионных методов [Wayne P. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) performance standards for antimicrobial disk diffusion susceptibility tests 19th ed. approved standard. CLSI document M100-S19 2009]. Тестовые материалы в количестве 40 мкл (по 0.2 мг индивидуальных соединений) растворяли в ДМСО и наносили на стерильные бумажные диски (6 мм диаметр, Schleicher and Schuell, D, ref. no. 321860). Ампициллин, тетрациклин и нистатин в концентрации 200 мкг/диск были использованы как препараты сравнения. Контролем служил соответствующий растворитель. ДМСО испаряли в потоке воздуха при комнатной температуре. Диски были депонированы на поверхности инокулированных агаровых чашек и выдержаны 2 ч в холодильнике для предиффузии веществ в агаре. Чашки с бактериями инкубировали при 37°C в течение 24 ч, с грибами - при 26°C в течение 48 ч. Зона ингибирования (включая диаметр диска) была измерена и зарегистрирована после времени инкубации. Средние значения ингибирования были вычислены после 3-кратного повторения.

Результаты и их обсуждение.

Из сухожилий млекопитающих выделен и очищен коллаген. Выделены и очищены компоненты для РП: с антимикробной активностью – это алкалоиды (конвольвин и конволамин), полученные из надземной части и корней Convolvulus krauseanus; с пролиферативной активностью - индивидуальное соединение филлальбин. Данные соединения выделены из растений рода Convolvulus (C. subhirsutus, C. krauseanus) в лаборатории алкалоидов ИХРВ АН РУз, под руководством проф. С.Ф. Ариповой. Все соединения по структуре имеют общий скелет тропана (8-азабициклооктана), являются сложными эфирами аминоспирта тропина и вератровой (конвольвин, конволамин) кислоты и отличаются лишь заместителем при атоме азота: конвольвин - R₁ = H, R₂ = CH₃; конволамин- R₁ = CH_3, R₂ = CH₃ и филлальбин- R₁ = CH_3, R₂ = H.

Первоначальный скрининг алкалоидов был проведен при концентрации 100 мкг/мл на двух типах нормальных клеток млекопитающих – культуре клеток фибробластов (ККФ) и первичной культуре клеток гепатоцитов (ПКГ), полученных неферментативным методом. Токсичность и пролиферативную активность на клетках проводили нейтрально-красным методом. В качестве положительного контроля на цитотоксичность использовали высокотоксичный алкалоид колхицин. В качестве отрицательного контроля служили клетки, в которые вносили только среду культивирования (табл. 1).

Таблица 1.

Цитотоксическая активность алкалоидов в концентрации 100 мкг/мл, % ингибирования роста клеток (М ± м, n = 9, Р<0,05)

Как видно из таблицы 1, высокую цитотоксическую активность показали алкалоиды конвольвин и колхицин, в то время как конволамин был чуть менее токсичен, а филлальбин не ингибировал рост клеток фибробластов в данной дозе и незначительно подавил рост гепатоцитов.

Наибольший интерес для практической медицины имеют вещества, активные в низких и очень низких концентрациях. В наших экспериментах мы также исследовали эти же соединения в концентрации 10 мкг/мл (табл. 2).

Таблица 2.

Цитотоксическая активность алкалоидов в концентрации 10 мкг/мл, % ингибирования роста клеток (М ± м, n = 9, Р<0,05)

Как видно из таблицы 2, токсичность конвольвина в данной концентрации лишь слегка снизилась, но остаётся высокой, в то время как токсичность конволамина и филлальбина по сравнению с колхицином и конвольвином практически отсутствует и более того проявляется пролиферативный эффект на клетках фибробластах под воздействием филлальбина (табл. 3.)

Таблица 3.

Воздействие веществ на ККФ (М ± м, n = 6, Р<0,05)

Как видно из таблицы 3, все алкалоиды показавшие очень низкую цитотоксичность относительно колхицина, в очень низких концентрациях не вызывают цитотоксического эффекта на здоровых клетках кожи, а при концентрации 0,6 – 1,25 мкг/мл вызывают пролиферацию фибробластов.

Длительное воздействие (72 часа) на ККФ данных алкалоидов в концентрации 0,15 - 5 мкг/мл значительных изменений не показало при постановке теста с нейтральным красным (табл. 4).

Таблица 4.

Процент живых клеток фибробластов, после 72 часового воздействия веществ (М ± м, n = 6, Р<0,05).

Как видно из таблицы 4, длительное воздействие данных алкалоидов (около 3 суток) в концентрациях от 2,5 до 0,15 мкг/мл не приводит к значительным изменениям пролиферативной активности клеток. А при снижении концентрации веществ наблюдается скачок пролиферации, особенно при концентрации 0,3 – 0,6 мкг/мл. Тем не менее, при концентрации 5 – 10 мкг/мл наблюдается значительное ингибирование клеток, свидетельствующее о кумулятивном эффекте алкалоида конволамина.

На основании полученных данных можно заключить, что наиболее перспективными соединениями для дальнейшего исследования являются малотоксичные для здоровых клеток алкалоиды – конволамин и филлальбин, а филлальбин при этом интересен ещё и с пролиферативно-регенеративной стороны.

Для изучения острой, хронической и специфической (антимикробной) активности в дальнейшем алкалоиды конвольвин и конволамин исследовались не как индивидуальные соединения, а как сумма алкалоидов, где конвольвина было 70%, а конволамина 30%, с целью экономии средств, так как данные соединения оставлены в исследовании для сравнения, как высокотоксичные. Изучение острой токсичности суммы алкалоидов (конвольвина, конволамина) и индивидуального алкалоида филлальбина, выделенных из растений рода Convolvulus, проведено на половозрелых белых крысах-самцах с исходной массой тела 138-160 гр. Экспериментальные группы были сформулированы по 6 штук в каждой. Предоставленные на испытание алкалоиды разводили до получения основных разведений – 200 мг/кг, вначале 96⁰ этиловым спиртом, а затем –двукратные разведения в физрастворе и получали таким образом следующие концентрации алкалоидов: 200-100-50-25-12,5-6,25-3,12 мг/кг, которые вводили однократно внутривенно (в/в) и подкожно (п/к). Спустя 3-4 часа после введения изучаемых алкалоидов животным давали натуральные и брикетные корма. Наблюдение за экспериментальными животными проводилось на протяжении 14 суток. Симптомы интоксикации у животных отмечены при введении суммы алкалоидов в дозах 12,5 мг/кг и выше, а в дозе 100 мг/кг наблюдалась 100% гибель животных при введении данной суммы алкалоидов в/в и п/к. Введение алкалоида филлальбина в дозе 100 мг/кг вызывала гибель 10% животных и симптомы интоксикации у выживших животных, которые проходили спустя сутки. Дозы филлальбина 50 мг/кг и ниже не вызывали симптомов интоксикации и гибели животных. В результате эксперимента установлено, что для суммы алкалоидов (конвольвина, конволамина) LD₅₀ = 25 мг/кг (в/в) и 50 мг/кг (п/к), а для филлальбина LD₅₀ = 150 мг/кг (в/в) и 200 мг/кг (п/к).

Изучение местного действия суммы алкалоидов (конвольвина, конволамина) и индивидуального алкалоида филлальбина, выделенных из растений рода Convolvulus на кожные покровы и слизистую оболочку глаз, а также способность проникать через неповрежденную кожу проводили на белых крысах. Растворы алкалоидов наносили на кожу экспериментальных животных из расчета 10 мг/см^2,. Реакцию кожи регистрировали по окончанию 4-х часовой экспозиции через 1 и 16 часов, после однократной аппликации. Установлено, что алкалоиды – филлальбин, и сумма алкалоидов (конволамин, конвольвин) не вызывают раздражения кожных покровов. Изучено также кожно-резорбтивное действие растворов алкалоидов из расчета 10 мг/см² при многократном воздействии (20 накожных аппликаций) на кожные покровы белых крыс. Установлено, что в течение всего периода эксперимента гибели животных и клинических признаков интоксикации не наблюдалось.

Таким образом, можно сделать вывод, что изучаемые алкалоиды не обладают раздражающим действием на кожу при многократном воздействии.

Для выявления кожно-резорбтивного действия белых крыс фиксировали в специальных станках. Хвосты подопытных животных погружали в пробирки с растворами алкалоидов (10 мг/мл) на 4 часа при температуре 36-37⁰С. После окончания эксперимента кожу хвостов обмывали водой с мылом. В течение 3-х недель наблюдения за экспериментальными животными признаков интоксикации и гибели не отмечено.

Изучено действие растворов вышеуказанных алкалоидов на слизистую оболочку глаз. Для этого в конъюктивальный мешок правого глаза кролика однократно вносили по 2 капли растворов алкалоидов (10 мкг/мл), левый глаз служил контролем, куда вносили капли физ раствора. Под влиянием исследуемых объектов через 1,5 минуты отмечалось слезотечение. Через 2-3 минуты указанное явление полностью  прекращалось.

Таким образом, результаты исследований позволяют констатировать отсутствие местного кожного и кожно-резорбтивного действия изученных алкалоидов, а также раздражающего действия на слизистую глаз.

Изучена субхроническая токсичность алкалоидов - суммы алкалоидов (конвольвина, конволамина) и индивидуального алкалоида филлальбина. Опыты проводили на белых беспородных крысах – самках массой 150-160г. Растворы алкалоидов вводили в желудки крыс ежедневно в дозах 5-10-50 мг/кг в течение одного месяца. Каждую дозу испытывали на шести крысах. Контрольной группе животных в аналогичных условиях вводили воду. Все подопытные и контрольные животные находились в одинаковых условиях и на обычном рационе. На протяжении всего опыта животные находились под ежедневным наблюдением; регистрировали общее состояние, поведение, потребление корма и воды, состояние волосяных покровов и слизистых оболочек. После последнего введения алкалоидов у всех групп животных из хвостовой вены, путём частичной резекции (0,5-1,0 см), были взяты аликвоты крови для определения развернутых показателей на гематологическом анализаторе ВС-3000 (Mindray, P.R.China). Затем под легким эфирным наркозам у животных, путем одномоментной декапитации, собирали кровь для биохимических исследований, извлекали внутренние органы для морфологических исследований.

Биохимические показатели сыворотки крови определяли унифицированными методами с использованием наборов реактивов фирмы CYPRESS Diagnostics (Бельгия) на биохимическом анализаторе ВА-88 А (Mindray, P.R.China).

Результаты проведенных исследований показали, что длительное пероральное применение алкалоидов тропанового ряда в низкой дозе, хорошо переносятся подопытными животными. Все подопытные животные не отличались от контрольных крыс по общему состоянию, поведению, приросту массы тела. Гематологические и биохимические показатели крови крыс, принимавших изучаемые препараты в дозах 5-10 мг/кг, находятся в пределах допустимых общепринятых норм и показателей интактной группы животных (Табл. 5), но с повышением дозы показатели меняются в сторону патологии при длительном приёме суммы алкалоидов (Табл.6).

Как видно из таблицы 6, показатели активности ферментов - щелочной фосфотазы, аспартат- и аланин-аминотрансфераз достоверно увеличиваются (Р< 0,002) у животных принимавших в течение месяца сумму алкалоидов (конвольвина, конволамина) в дозе 50 мг/кг, увеличивается также и холестерин в крови (Р< 0,05), в то время как показатель общего белка снижается (Р< 0,05), что свидетельствует о сбоях, как минимум в работе органов пищеварительного тракта и неком кумулятивном эффекте сумм алкалоидов.

В этой связи использовать дозу 50 мг/кг сумм алкалоидов в терапии не желательно и максимальная доза не должна превышать 10 мг/кг. Филлальбин в дозе 50 мг/кг безопасен при внутривенном введение.

Проверены антимикробные свойства сумм алкалоидов конвольвина и конволамина, и филлальбина. Изучение антимикробной активности суммы алкалоидов (СА) и филлальбина (Ф) проводили с использованием условно-патогенных штаммов микроорганизмов, предоставленных НИИЭМИЗ МЗ РУз (1 штамм грамотрицательных бактерий – Escherichia coli (№4777), 1 штамм грамположительных бактерий - Staphylococcus epidermidis (№МЗ-87) и 1 штамм грибов рода Candida – C. albicans (№723)). Для исследования применяли суточную агаровую культуру бактерий, из которых перед опытом готовили суспензию бактерий с концентрацией 10⁸ микробных клеток на 1 мл растворителя. Предоставленные на испытание алкалоиды растворяли в этиловом спирте до стоковой концентрации – 20%, а стоковый раствор разбавляли далее физиологическим раствором в 2 и более раз. В результате для исследований подготовили следующие концентрации алкалоидов: 20%, 10%, 5%, 2,5%, 1,25%, 0,6% и 0,3%. Приготовленную взвесь исследуемых штаммов микроорганизмов засевали методом «газона» на поверхность питательного агара в чашках Петри, излишек жидкости тщательно отсасывали стерильной пипеткой, а поверхность агара подсушивали. Для каждого штамма использовали отдельную чашку Петри с питательным агаром. На поверхность засеянного питательного агара наносили исследуемые алкалоиды в объеме 0,05 мл из каждого разведения. Для каждой исследуемой культуры бактерий использовали по 2 чашки с питательным агаром. После подсыхания капель раствора алкалоидов все посевы инкубировали в термостате при 37⁰ С. Также были поставлены контроли ростовых качеств бактерий взятых в эксперимент. Через сутки инкубации производили учёт полученных результатов. Наличие зоны отсутствия роста микроорганизмов отмечали знаком «+»: «+++» - зона задержки роста более 25 мм; «++» - зона задержки роста 20-25 мм; «+» - зона задержки роста до 20 мм; «-» - отсутствие зоны задержки роста. Также определена минимальная ингибирующая концентрация, подавляющая рост микроорганизмов (МИК). Результаты исследований представлены в таблице 7.

Таблица 7.

Антимикробная активность алкалоидов на референс-штаммах микроорганизмов

Примечание:+++ зона задержки роста более 25 мм;++ зона задержки роста 20-25 мм;+ зона задержки роста до 20 мм;- отсутствие зоны задержки роста.

Установлено, что сумма алкалоидов обладает избирательной противомикробной активностью и подавляет рост ряда грамотрицательных и грамположительных бактерий, а также рост грибов рода Candida. Филлальбин также подавляет рост микроорганизмов, но в гораздо высоких концентрациях, чем исследуемая сумма алкалоидов. Установлено, что филлальбин более активен, чем сумма алкалоидов по отношению к C. albicans.

В результате проведённых исследований из изученных алкалоидов в качестве биологически активного компонента для раневого покрытия на основе коллагена был отобран алкалоид филлальбин. Данный алкалоид в концентрациях 10 -12,5 мкг/мл был внесён в гелеобразную форму коллагена, после полимеризации была образована тонкая плёнка раневого покрытия, пригодного для дальнейших доклинических исследований в качестве нового раневого покрытия с антимикробной и пролиферативной активностью.

Список литературы:
1. Азимова Ш.С., Ураков Б.А., Цеомашко Н.Е. Оценка цитотоксичности лекарственных средств, изделий медицинского назначения, косметических средств, химических соединений, пестицидов и средств для ветеринарии. Методические рекомендации. - Ташкент: ИХРВ АН РУз, 2016. - 46 с.
2. Гладкова Е.В., Норкин И.А., Белова С.В., Бабушкина И.В., Мамонова И.А. Биодеградируемое раневое покрытие и способ получения биодеградируемого раневого покрытия. Патент РФ № 2519158, 2014 г. - 33 с.
3. Кириленко Ю.К., Постнов С.Е., Решетов И.В., Чиссов В.И., Юданова Т.Н. Повязка для лечения ран. Патент РФ №2219954, 2003 г. - 32 с.
4. Куринова М.А., Гальбрайх Л.С., Скибина Д.Э. Современные раневые покрытия (Обзор) // Современная медицина: актуальные вопросы: сб. ст. по матер. XLVIII-XLIX междунар. науч.-практ. конф.– Новосибирск: СибАК, 2015. № 10-11(43). - С. 2-19
5. Цеомашко Н.Е., Азимова Ш.С. Получение первичных культур клеток кожи – фибробластов и кератиноцитов // Медицинский журнал Узбекистана. – 2013. - №4. - С. 97-100.
6. Цеомашко Н.Е., Цай Е.A., Азимова Ш.С. Получение первичных культур клеток гепатоцитов для in vitro исследований// Узбекский биологический журнал. - 2015. - № 2. - С. 40-42.
7. Цыган В.Н. Патогенетическое обоснование применения биоактивных раневых покрытий на догоспитальном этапе медицинской помощи / В.Н. Цыган, В.И. Бадалов, К.Н. Касанов // Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях. – 2013. – № 4. – С. 66–70.
8. Чумаков А.А., Дмитриева Л.А., Комнова З.Д. и др.// Журнал «Стоматология». - 1985. - №5, - C.6-9.
9. Frykberg RG, Driver VR, Carman D, Lucero B, Borris-Hale C, Fylling CP, Rappl LM, Clausen PA. Chronic wounds treated with a physiologically relevant concentration of platelet-rich plasma gel: a prospective case series //Ostomy Wound Manage. – 2010. – V. 56(6). – Р. 36-44.
10. Joshua S. Boateng Wound healing dressings and drug delivery systems: a review / Joshua S. Boateng [et al.] // Journal of pharmaceutical sciences. – 2008. – V. 97, – № 8. – Р. 2892–2923.
11. Levenson JL, Valverde R, Olbrisch ME. Factitious wound infections in an altruistic living liver donor// Prog Transplant. – 2008. –V. 18(1). – Р. 22-24.