Роль Mycobacterium tuberculosis Rv2349c гена в лекарственной устойчивости

АННОТАЦИЯ

Фосфолипаза Cs (PLC) считается фактором вирулентности и патогенности у множества бактерий. Одной из важнейших проблем в вирулентности считается фактор устойчивости к антибиотикам. Чтобы узнать, какое влияние имеет ген Rv2349c, были проведены исследование на проницаемость клеточной стенки и минимальное ингибирование антибиотиками. Исследование показало что, Rv2349c увеличивает проницаемость клеточной стенки Micobacterium tuberculosis для гидрофильных компонентов, но снижает проницаемость для гидрофобных компонентов. Полученные результаты позволяют определить новые подходы в изучении биологических, химических и структурных свойств, клеточной стенки микобактерий, изучив которых, можно выявить новые противотуберкулезные препараты.

ABSTRACT

Phospholipase Cs (PLC) is considered a virulence and pathogenicity factor in many bacteria. Antibiotic resistance is considered to be one of the most important problems in virulence. To find out what impact has a gene Rv2349c, we conducted a study on the permeability of the cell wall and minimal inhibition by the antibiotics.  The study showed that Rv2349c increases the permeability of the cell wall of tuberculosis Micobacterium for hydrophilic components, but reduces the permeability to hydrophobic components. The obtained data make it possible to identify new prospects for the study of biological, chemical and structural properties of the cell wall of mycobacteria, studying which, it is possible to identify new anti-TB drugs.

Ключевые слова: Micobacterium tuberculosis, туберкулез, фосфолипаза,  минимальная ингибирующая онцентрация, незистентность на антибиотик

Keywords: Micobacterium tuberculosis, tuberculosis, phospholipase, minimal inhibitory oncentration, antibiotic resistance

В последние годы было получено много информации о факторах вирулентности M. tuberculosis, которые кодируются различными генетическими детерминантами. В качестве факторов вирулентности фосфолипазы групп А1, А2, С и D играют важную роль при различных бактериальных инфекциях [5]. Среди них фосфолипазы С играют значительную функциональную роль. Они генерируют гидролиз диацилглицерина, который участвует в активации внеклеточных сигнальных киназ (Erk) через протеинкиназу C, что приводит к активации макрофагов [2,3].

Ген Mycobacterium tuberculosis Rv2349c кодирует фермент с активностью фосфолипазы С3, который является гидролизованным фосфатидилхолином и сфингомиелином. Rv2349c считается вероятным фактором вирулентности, который участвует в патогенезе Mycobacterium tuberculosis на уровне внутриклеточной выживаемости, путем изменения клеточных сигнальных событий или прямой цитотоксичности [каталитическая активность: фосфатидилхолин + H (2) O = 1,2 - диацилглицерин + холинфосфат. Rv2349c на H37Rv находится в 2627172 п.н. с длиной 508 белков и имеет длину гена 1527 п.н. Разрушение этого гена обеспечивает преимущество роста для роста H37Rv in vitro.

Важность фосфолипазы С в вирулентности микобактерий была выявлена путем демонстрации того, что тройная ΔplcABC  четырехкратная Δ plc и A B C D Mtb мутанты ослабляют инфекцию клубнекулоза у мышей [9].

Фосфолипаза С как вирулентный возбудитель туберкулеза стала предметом исследований. Исследование гена M.tuberculosis, кодируемого фосфолипазой c3 Rv2349c, имеет большое значение для вирулентности и патогенности. Изучение некоторых характеристик, функциональной системы как влияния антибиотиков на фосфолипазы  С может быть фактором вирулентности микобактерий даже на поздней стадии заболевания.

М. tuberculosis отображает широкий спектр сложных липидов и липогликанов на своей клеточной поверхности, которые играют важную роль в патогенезе, и гены ответственны для их биосинтеза, деградации и транспорта считаются потенциальным фактором вирулентности, которые предлагают новые цели для разработки лекарств

2. Материал и методы

2.1. Бактериальные штаммы, плазмиды и условия их культивирования

Штаммы Escherichia coli DH5α и Mycobacterium smegmatis mc2 155 были приобретены в Институте современных биофармацевтических препаратов Китая. Антибиотики, используемые в этом исследовании, были приобретены у фирмы Sigma.

Жидкая среда Middlebrook (MB) 7H9 с добавлением 0,05% Tween 80, 0,5% , глицерина и 0,2%, глюкозы или агара Middlebrook (MB) 7H10. Для питательных сред использовали антибиотик гигромицин (25 мкг / мл для микобактерий и 50 мкг / мл для кишечной палочки) и ампициллин (50 мкг / мл). Все культуры инкубировали при 37°С. Штаммы бактерий, плазмиды и последовательности праймеров, использованные при конструировании рекомбинантных штаммов, перечислены в таблице 1.

2.2. Конструирование рекомбинантного M. smegmatis Rv2349c

Ген Rv2349c был успешно клонирован (последовательность ДНК получены из https://mycobrowser.epfl.ch/) с использованием  геномной ДНК M. tuberculosis H37Rv и специальных праймеров (таблица 1). Продукт ПЦР непосредственно лигировали в плазмиду pALACE. Рекомбинантная плазмида Rv2349c-pALACE была клонирована в Escherichia coli DH5α и культивирована при 37°С. Плазмиду Rv2349c-pALACE и pALACE встраивали в M. smegmatis mc2 155 с помощью электропорации.

Успешно рекомбинированный Ms-Rv2349c был дополнительно подтвержден с помощью ПЦР-амплификации. Затем бактерии Ms_Rv2349c и Ms_pALACE культивировали в жидкой среде 7H9 Middlebrook (MB) с добавлением 0,05% (по объему) Tween 80, 0,5% (по объему) глицерина и 0,2% (по объему) глюкозы или Middlebrook (MB). ) 7H10 агаровые пластины.

После индукции бактериальные гранулы собирали и обрабатывали ультразвуком. Образцы были подвергнуты SDS-PAGE и далее обнаружены через вестерн-блоттинг с антителом против Myc (TIANGEN, Китай). Пятна образовались после инкубации со вторичными антителами козы моноклональные антитела против мышиного IgG-HRP, пероксидазой хрена (TIANGEN, Китай).

2.3. Субклеточная локализация белка Rv2349c у M. smegmatis

MS_Rv2349c и MS_Vec выращивали до OD 600 нм  0,6-0,8 с добавлением 28 мМ ацетамида для индукции в течение 16 часов. Гранулы бактериальных клеток собирали и обрабатывали ультразвуком, затем целые лизаты центрифугировали при 3000g в течение 5 минут при 4 ° C для отделения интактных клеток и клеточного дебриса. Супернатант центрифугировали при 27000g в течение 40 минут при 4°C, фракцию клеточной стенки, клеточную мембрану и цитоплазматическую фракцию собирали раздельно с последующим SDS-PAGE и вестерн-блоттингом для определения экспрессии и местоположения белка Rv2349c (рис 1). GroEL2 представлял собой цитоплазматический контроль нативного M. smegmatis, содержащий эндогенный гистидин.  Для анализа использовали меченное антитело anti-his tag (TIANGEN, Китай).

2.4. Анализ поглощения бромистого этидия и Nile Red

Накопление бромистого этидия (EtBr) (сигма) и Nile Red (сигма) был измерен. Штаммы Ms Vec и Ms Rv2349c были выращены в среде 7H9 до OD600 1,0, промывали и ресуспендировали с PBS, содержащим 0,05% Tween80 (PBST). OD600 из ресуспендированные клетки доводили до 0,8, и 200 мкл этой клеточной суспензии добавляли в трех повторностях к 96-луночному черному фторопласту. Для анализа поглощения EtBr и Nile Red культуры окрашивали

EtBr (1 г / мл) и нильским красным (20 М), соответственно. Накопление этих красителей измеряли по флуоресценции в указанные моменты времени с использованием Synergy H1 Hybrid Microplate Reader со спектром излучения с λ 544, 590 нм. Все данные были нормализованы к нулевому показанию каждой лунки. Все эксперименты были повторены не менее трех раз, и были получены аналогичные результаты.

2.5. Минимальные ингибирующие концентрации (MIC)

 Ингибирование роста (MIC) определяли, как ранее описано (Ribeiro et al., 2011) с использованием метода двойного разбавления бульона. После инкубации в течение 3 дней при 37 °С, самая низкая концентрация противомикробного препарата, которая предотвратил видимый рост микроорганизма после инкубации был определен как MIC.

Результаты

Множество исследований  выявили, что Фосфолипаза Cs (PLC) считается фактором вирулентности и патогенности у множества бактерий. Одной из  важнейших проблем в вирулентности считается фактор устойчивости к антибиотикам.

Антибиотико-устойчивость микобактерии подталкивает к  изучению молекулярных механизмов микобактерии,  которые могут являться  фактором резистентности [1, 7]

При изучении фактора вирулентности  ген EAI5 Mycobacterium tuberculosisа (инвентарный номер GenBank CP006578) [8,10], стал считаться гипотетическим белком фактора вирулентности, обладающий фосфатидил-инозитол-специфической активностью, приводящей к фосфолипазе. Трехмерная структура этого белка была резервирована в базе данных для  исследований и терапевтических целей [4].

Ген Mycobacterium tuberculosis Rv2349c кодирует фермент с активностью фосфолипазы С3, который является гидролизованным фосфатидилхолином и сфингомиелином. Rv2349c считается вероятным фактором вирулентности, который участвует в патогенезе Mycobacterium tuberculosis на уровне внутриклеточной выживаемости, путем изменения клеточных сигнальных событий или прямой цитотоксичности [6].

Чтобы узнать какую роль играет ген Rv2349c при устойчивости к антибиотикам, было провелдено исследование на проницаемость клеточной стенки  и минимальное ингибирование антибиотиками. 

 Таблица 1.

Лист праймеров, использованых в исследовании

Рисунок 2.

Для выявления влияния действия Rv2349с  на устойчивость к антибиотикам, рекомбинантные Ms Vec и Ms Rv2349с штаммы подвергались различными противотуберкулезными препаратами, как описано в методе. Выявлена у Ms Rv2349с повышенная устойчивость к росту в среде MB 7H10 с добавлением нескольких  антибиотиков указанной концентрации.

Значения MIC для хлорамфеникола, рифампицина и норфлоксацина.  Ms Vec и Rv2349c составили 6,5 и 26 ug / ml; 0,42 и 1,71 ug / ml;  0,5 и  2.0 ug / ml  соответственно.

Чтобы понять повышенную лекарственную устойчивость микобактерии штамма Ms Rv2349с, вызванное общим уменьшением клеточной стенки, мы измерили проницаемость клеточной стенки путем исследования накопления суррогатных соединений EtBr и Nile Red в штаммах Ms Vec и Ms Rv2349с  с помощью флуоресценции. Результаты показали, что EtBr накапливается больше у Ms Rv2349с, по сравнению, чем у штаммов Ms Vec, что указывает на повышение проницаемости клеточной стенки (рис. 2А). Тем не менее, накопление Nile Red не показало существенной разницы между штаммами Ms Vec и Ms Rv2349с (рис. 2Б). EtBr и Nile Red являются представителями гидрофильных и гидрофобных соединений, соответственно. Из исследования можно утверждать, что Rv2349c  увеличивает проницаемость клеточной стенки Micobacterium tuberculosis  для гидрофильных компонентов, но снижает проницаемость для гидрофобных компонентов. Интересно, что мы обнаружили, что штаммы Ms Rv2349с были более устойчивы к различным гидрофобным препаратам, таким как хлорамфеникол, норфлоксацин. Исходя из полученных результатов, можно предположить, что изменение проницаемости клеточной стенки Rv2349с способствует устойчивости М. Туберкулеза к различным стрессам.

Список литературы:
1. Akos Somoskovi et al. Respir Res2001 2(3): 164 [PMID: 11686881,18
2. Cuschieri et al., 2006
3. Carter, A. B., M. M. Monick, and G. W. Hunninghake. 1999. Both ERK and p38 kinases are necessary for cytokine gene expression. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. In press.
4. Debdoot Gupta, at all. In silico identification and characterization of a hypothetical protein of Mycobacterium tuberculosis EAI5 as a potential virulent factor. Bioinformation 12(3): 182-191 (2016)
5. J.G. Songer, Bacterial phospholipases and their role in virulence, Trends Microbiol. 5 (1997) 156–161.
6. J..C. Bakala N'Goma et al Evidence for the cytotoxic effects of Mycobacterium tuberculosis towards macrophages.. / Biochimica et Biophysica Acta 1801 (2010) 1305–1313
7. Loerger T.R. et al.PLoS ONE 2013 8(9): e75245 [PMID: 24086479
8. P. Kubica, and L. G. Wayne (ed.), The myco-bacteria: a sourcebook. Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y
9. C. Raynaud, C. Guilhot, J. Rauzier, Y. Bordat, P.V., R. Manganelli, I. Smith, B. Gicquel, M. Jackson, Phospholipases C are involved in the virulence of Mycobacterium tuberculosis, Mol. Microbiol. 45 (2002) 203–217
10. Segal, W.1984. Growth dynamics of in vivo and in vitro grown Mycobacterial pathogens, p. 547–573.