Клонирование рекомбинантной плазмидной ДНК pBacPAK8-polh- PreS2-S, кодирующий PreS2-S регион вируса гепатита B (HBV) в бакуловирусах

Cloning of recombinant plasmid DNA pBacPAK8-polh- PreS2-S coding PreS2-S hepatitis B (HBV) region in baculoviruses
Цитировать:
Клонирование рекомбинантной плазмидной ДНК pBacPAK8-polh- PreS2-S, кодирующий PreS2-S регион вируса гепатита B (HBV) в бакуловирусах // Universum: химия и биология : электрон. научн. журн. Абдурахманов Ж.М. [и др.]. 2019. № 10 (64). URL: https://7universum.com/ru/nature/archive/item/7857 (дата обращения: 23.09.2020).
Прочитать статью:

АННОТАЦИЯ

На основе бакуловирусного вектора pBacPAK8 сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pBacPAK8-polh-PreS2-S (6496 п.н.), кодирующая PreS2-S белок, состоящий из 282 аминокислот. Данная плазмидная ДНК может быть использована для экспрессии рекомбинантного поверхностного антигена, кодируемого РreS2-S регионом Вируса гепатита В человека (HBV), рассматриваемого как потенциальный кандидат для создания новых вакцин или диагностических средств.

ABSTRACT

Based on the baculovirus vector pBacPAK8, a recombinant plasmid DNA pBacPAK8-polh-PreS2-S (6496 p.n.) encoding PreS2-S protein consisting of 282 amino acids has been constructed. This plasmid DNA can be used to express a recombinant surface antigen encoded by the PreS2-S region of the human virus hepatitis B (HBV), considered as a potential candidate to create new vaccines or diagnostic tools.

 

Ключевые слова: бакуловирусной вектор, рекомбинантная ДНК, клонирование, ПЦР, трансформация, HBV.

Keywords: baculovirus vector; recombinant DNA; cloning; PCR; transformation; HBV.

 

Введение

Вирусный Гепатит В (HBV) представляет собой серьезную глобальную проблему здравоохранения. Вирус может вызывать хроническую инфекцию с высоким риском летального исхода от цирроза и рака печени. По оценкам ВОЗ, в 2015 г. в мире насчитывалось 257 млн человек, живущих с хронической инфекцией гепатита В и в 2017 г. число новых инфицированных составило 1,1 млн человек. Заражение HBV можно предотвратить с помощью безопасных, доступных и эффективных вакцин [1].

Оболочка HBV состоит из трёх родственных белков, известных как большой (L), средний (М) и основной (S) поверхностные антигены вируса гепатита В (HBsAg). Все эти белки имеют общий гидрофобный S-регион с дополнительными N-концевыми участками для М- и L-белков. S- HBsAg кодируется только S-регионом вируса гепатита В, M-HBsAg состоит из S-региона, дополненного 55 аминокислотами preS2-pегиона (т.е. состоит из preS2-S белка), L-HBsAg содержит кроме preS2-S белка дополнительно 108-119 аминокислот в N-конце, кодируемых preSl-регионом HBV оболочки (те. L-HBsAg состоит из preSI-preS2-S белка) [2]. Основополагающим этапом в получении рекомбинантных белков в системе бакуловирусы/клетки насекомых является конструирование специальных плазмидных ДНК, которые содержат ген, кодирующий чужеродный белок [3-4], в данном случае PreS2-S-peгион вируса гепатита В человека (M-HBsAg), а также определенный фрагмент генома бакуловируса.

Известны рекомбинантные плазмидные ДНК, кодирующие РreS2-S регион вируса гепатита В, сконструированные на основе трансферных векторов pPICZα [5], pTB-04 [6], pA0803, pA0804, pA0811 [7], которые предназначены для экспрессии белков в дрожжах Pichia pastoris. Наиболее близким аналогом является рекомбинантная плазмидная ДНК pBHep-2 (11276 п.н.), кодирующая PreS2-S регион вируса гепатита В человека, сконструированная на основе трансферного вектора pBК273 [8]. Однако данная плазмидная ДНК содержит не только ген PreS2-S, но и ген GFP под контролем промотора бакуловирусной цистеиновой протеиназы (v-cath).

Задача исследования состоит в создании новой рекомбинантной плазмиды ДНК pBacPAK8-polh- PreS2-S, кодирующая PreS2-S регион вируса гепатита в человека на основе бакуловирусного вектора pBacPAK8 для использования в системе экспрессии бакуловирусы/клетки Bombyx mori.

Материалы и методы

Плазмидная ДНК pBacPAK8-polh-PreS2-S создана на основе бакуловирусного вектора pBacPAK8. Плазмида pBacPAK8 представляет собой вектор, содержащий фрагменты генома вируса ядерного полиэдроза тутового шелокпряда (Bombyx mori), размером 5.538 п.н., промоторную и терминаторную последовательности гена полиэдрина, без кодирующей части, и полилинкер, содержащий уникальные сайты клонирования XhoI, Acc65I, KpnI, SacI, EcoRI, NotI и др., а также фрагмент кДНК, содержащий PreS2-S ген вируса гепатита В человека размером 965 п.н., и ген устойчивости к ампициллину для селекции в E. coli.

Подготовка векторов и вставки (гена) для лигирования.

В соответствии с физической картой плазмиды pBacPAK8 (Рисунок 1) была проведена последовательная обработка рестриктазами EcoRI и NotI:

EcoRI: 5´-G↓AATTC-3´

            3´-CTTAA↓G-5´

NotI:   5´-GC↓GGCCGC-3´

           3´-CGCCGG↓CG-5´

Этап подготовки гена РreS2-S включал в себя обработку плазмидной ДНК pBm-vc-USDS-EGFP-PreS2-S (1 мкг), содержащей этот ген, в соответствии с физической картой рестриктазами EcoRI и NotI. В результате проведенных реакции были получены как фрагмент РreS2-S, так и вектор pBacPAK8 с "липкими" концами, позволяющими провести «направленную» лигирование. Во избежание замыкания вектора была проведена его обработка щелочной фосфатазой по методу [9]. Фрагмент плазмидной ДНК, содержащей РreS2-S регион вируса гепатита В, извлекали из 0,7% агарозного геля после электрофореза по методу [9].

Лигирование и трансформация полученных плазмид в электрокомпетентные клетки E.coli Neb-5α. Анализ полученных клонов. Лигирование вектора pBacPAK8 с фрагментом, содержащим кДНК PreS2-S региона вируса гепатита В осуществляли с применением ДНК-лигазы фага Т4 в минимальном объёме (10 мкл) в молярном соотношении 1:10 соответственно с помощью ДНК-лигазы фага Т4. Реакция проходила при 16°С в течение ночи. Далее лигазной смесью трансформировали клетки штамма Escherichia coli NEB-5a. Идентификацию клонов, содержащих РreS2-S ген проводили методом ПЦР с применением специфических праймеров к РreS2-S региону вируса гепатита В [10].

 

Рисунок 1. Схема конструирования плазмиды pBacPAK8-polh-PreS2-S

 

Результаты и обсуждение

Продукты ПЦР (амплификаты) анализировали при помощи электрофореза в 1%-ном агарозном геле (Рисунок 2). Фрагмент ДНК с молекулярной массой, соответствующей массе фрагмента ДНК, амплифицированного в контрольном образце по окончании реакции свидетельствовало о наличии вставки в исследуемой плазмиде. Таким образом, методом ПЦР были выявлены клоны, содержащие PreS2-S регион ДНК вируса гепатита В. Был проведен рестриктный анализ для того чтобы определить правильность ориентации вставки.

При помощи сравнительного анализа рекомбинантной плазмиды pBacPAK8-polh-Pres2-S и исходной векторной плазмиды pBacPAK8 по единичному сайту EcoRI, после электрофореза были выявлены фрагменты ДНК, масса которых соответствует теоретическим расчётам по физическим картам данных плазмид. Результаты анализа оценивали после проведения электрофореза в 0,7% агарозном геле (Рисунок 3).

При расщеплении вектора pBacPAK8-polh-Pres2-S рестриктазой EcoRI, была получена линейная форма плазмиды, соответствующая 6,496 т.п.н. Дальнейшей расщеплением плазмиды рестриктазой NotI были получены фрагменты с массами 5,5 и 0,9 т.п.н., которые свидетельствуют о правильной ориентации кДНК Pres2-S региона вируса гепатита В в рекомбинантной плазмидной ДНК pBacPAK8-polh-Pres2-S.

 

Рисунок 2. ПЦР анализ PreS2- гена

 

Рисунок 3. Рестрикционный анализ pBacPAK 8-polh-preS2-S (C) (EcoR >I/6496 п.н.)

 

Выводы

Таким образом, сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pBacPAK8-polh-PreS2-S размером 6496 п.н., содержащая Pres2-S регион вируса гепатита В под промотором гена полиэдрина. Данная плазмидная ДНК может быть использована как потенциальный кандидат для создания новых вакцин или диагностических средств, так как она содержит несколько антигенных детерминант.

 

Список литературы:
1. Всемирная организация здравоохранения/ [Электронный ресурс]- Режим доступа: https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-b
2. Патент UZ IAP 03178. Рекомбинантная плазмидная ДНК pBHEP-2, кодирующая PreS2-S регион вируса гепатита В человека (M-HBsAg), и способ ее конструирования. 31.10.2006.
3. Kost TA, Condreay JP, Jarvis DL. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat Biotechnol. 2005, 23: 567-575.
4. Ikonomou L, Schneider YJ, Agathos SN. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 2003, 62: 1-20.
5. A.R. Awan, M.Y. Zahoor, M.M. Javed, M.E. Babar, Z. Salem. Expression of PreS2/S antigen of Hepatitis B virus isolated from Pakistan in yeast cells. Pak. J. Bot. 2012, vol. 44, pp. 355-359.
6. Патент EP0339567 A1. Expression of Hepatitis B PreS 2 protein in methylotrophic yeasts. 25.04.1989.
7. Патент US5670630 A. Gregory P. Thill, San Diego, Calif. Expression of Hepatitis B S and Pres2 proteins in methylotrophic yeasts. 23.09.1997.
8. Патент UZ № IАР 03178. Рекомбинантная плазмидная ДНК рВНер-2, кодирующая preS2-S регион вируса гепатита В человека (M-HBsAg), и способ ее конструирования. 30.10.2002.
9. Michael R. Green, J. Sambrook. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2012. 2028 p.
10. John M.S. Bartlett, David Stirling. Methods in Molecular Biology: PCR Protocols, 2nd ed. 2003. Vol. 226. 525 p.

 

Информация об авторах

младший научный сотрудник, Институт химии растительных веществ АН РУз, Узбекистан, г. Ташкент

junior researcher Institute of the Chemistry of Plant Substances Academy of Sciences at Uzbekistan, Uzbekistan, Tashkent

канд. хим. наук, старший научный сотрудник, Институт химии растительных веществ АН РУз, Узбекистан, г. Ташкент

candidate of Science, senior researcher Institute of the Chemistry of Plant Substances Academy of Sciences at Uzbekistan, Uzbekistan, Tashkent

младший научный сотрудник, Институт химии растительных веществ АН РУз, Узбекистан, г. Ташкент

junior researcher Institute of the Chemistry of Plant Substances Academy of Sciences at Uzbekistan, Uzbekistan, Tashkent

младший научный сотрудник, Институт химии растительных веществ АН РУз, Узбекистан, г. Ташкент

junior researcher Institute of the Chemistry of Plant Substances Academy of Sciences at Uzbekistan, Uzbekistan, Tashkent

д-р биол. наук, проф., Институт химии растительных веществ АН РУз, Узбекистан, г. Ташкент

doctor of Science, prof. Institute of the Chemistry of Plant Substances Academy of Sciences at Uzbekistan, Uzbekistan, Tashkent

мл. науч. сотр., Институт химии растительных веществ АН РУз., Узбекистан, г. Ташкент

junior researcher Institute of the Chemistry of Plant Substances Academy of Sciences of the Republic of Uzbekistan, Uzbekistan, Tashkent

Журнал зарегистрирован Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор), регистрационный номер ЭЛ №ФС77-55878 от 17.06.2013
Учредитель журнала - ООО «МЦНО»
Главный редактор - Ларионов Максим Викторович.
Top