Клонирование рекомбинантной плазмидной ДНК pBacPAK8-polh- PreS2-S, кодирующий PreS2-S регион вируса гепатита B (HBV) в бакуловирусах

АННОТАЦИЯ

На основе бакуловирусного вектора pBacPAK8 сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pBacPAK8-polh-PreS2-S (6496 п.н.), кодирующая PreS2-S белок, состоящий из 282 аминокислот. Данная плазмидная ДНК может быть использована для экспрессии рекомбинантного поверхностного антигена, кодируемого РreS2-S регионом Вируса гепатита В человека (HBV), рассматриваемого как потенциальный кандидат для создания новых вакцин или диагностических средств.

ABSTRACT

Based on the baculovirus vector pBacPAK8, a recombinant plasmid DNA pBacPAK8-polh-PreS2-S (6496 p.n.) encoding PreS2-S protein consisting of 282 amino acids has been constructed. This plasmid DNA can be used to express a recombinant surface antigen encoded by the PreS2-S region of the human virus hepatitis B (HBV), considered as a potential candidate to create new vaccines or diagnostic tools.

Ключевые слова: бакуловирусной вектор, рекомбинантная ДНК, клонирование, ПЦР, трансформация, HBV.

Keywords: baculovirus vector; recombinant DNA; cloning; PCR; transformation; HBV.

Введение

Вирусный Гепатит В (HBV) представляет собой серьезную глобальную проблему здравоохранения. Вирус может вызывать хроническую инфекцию с высоким риском летального исхода от цирроза и рака печени. По оценкам ВОЗ, в 2015 г. в мире насчитывалось 257 млн человек, живущих с хронической инфекцией гепатита В и в 2017 г. число новых инфицированных составило 1,1 млн человек. Заражение HBV можно предотвратить с помощью безопасных, доступных и эффективных вакцин [1].

Оболочка HBV состоит из трёх родственных белков, известных как большой (L), средний (М) и основной (S) поверхностные антигены вируса гепатита В (HBsAg). Все эти белки имеют общий гидрофобный S-регион с дополнительными N-концевыми участками для М- и L-белков. S- HBsAg кодируется только S-регионом вируса гепатита В, M-HBsAg состоит из S-региона, дополненного 55 аминокислотами preS2-pегиона (т.е. состоит из preS2-S белка), L-HBsAg содержит кроме preS2-S белка дополнительно 108-119 аминокислот в N-конце, кодируемых preSl-регионом HBV оболочки (те. L-HBsAg состоит из preSI-preS2-S белка) [2]. Основополагающим этапом в получении рекомбинантных белков в системе бакуловирусы/клетки насекомых является конструирование специальных плазмидных ДНК, которые содержат ген, кодирующий чужеродный белок [3-4], в данном случае PreS2-S-peгион вируса гепатита В человека (M-HBsAg), а также определенный фрагмент генома бакуловируса.

Известны рекомбинантные плазмидные ДНК, кодирующие РreS2-S регион вируса гепатита В, сконструированные на основе трансферных векторов pPICZα [5], pTB-04 [6], pA0803, pA0804, pA0811 [7], которые предназначены для экспрессии белков в дрожжах Pichia pastoris. Наиболее близким аналогом является рекомбинантная плазмидная ДНК pBHep-2 (11276 п.н.), кодирующая PreS2-S регион вируса гепатита В человека, сконструированная на основе трансферного вектора pBК273 [8]. Однако данная плазмидная ДНК содержит не только ген PreS2-S, но и ген GFP под контролем промотора бакуловирусной цистеиновой протеиназы (v-cath).

Задача исследования состоит в создании новой рекомбинантной плазмиды ДНК pBacPAK8-polh- PreS2-S, кодирующая PreS2-S регион вируса гепатита в человека на основе бакуловирусного вектора pBacPAK8 для использования в системе экспрессии бакуловирусы/клетки Bombyx mori.

Материалы и методы

Плазмидная ДНК pBacPAK8-polh-PreS2-S создана на основе бакуловирусного вектора pBacPAK8. Плазмида pBacPAK8 представляет собой вектор, содержащий фрагменты генома вируса ядерного полиэдроза тутового шелокпряда (Bombyx mori), размером 5.538 п.н., промоторную и терминаторную последовательности гена полиэдрина, без кодирующей части, и полилинкер, содержащий уникальные сайты клонирования XhoI, Acc65I, KpnI, SacI, EcoRI, NotI и др., а также фрагмент кДНК, содержащий PreS2-S ген вируса гепатита В человека размером 965 п.н., и ген устойчивости к ампициллину для селекции в E. coli.

Подготовка векторов и вставки (гена) для лигирования.

В соответствии с физической картой плазмиды pBacPAK8 (Рисунок 1) была проведена последовательная обработка рестриктазами EcoRI и NotI:

EcoRI: 5´-G↓AATTC-3´

            3´-CTTAA↓G-5´

NotI:   5´-GC↓GGCCGC-3´

           3´-CGCCGG↓CG-5´

Этап подготовки гена РreS2-S включал в себя обработку плазмидной ДНК pBm-vc-USDS-EGFP-PreS2-S (1 мкг), содержащей этот ген, в соответствии с физической картой рестриктазами EcoRI и NotI. В результате проведенных реакции были получены как фрагмент РreS2-S, так и вектор pBacPAK8 с "липкими" концами, позволяющими провести «направленную» лигирование. Во избежание замыкания вектора была проведена его обработка щелочной фосфатазой по методу [9]. Фрагмент плазмидной ДНК, содержащей РreS2-S регион вируса гепатита В, извлекали из 0,7% агарозного геля после электрофореза по методу [9].

Лигирование и трансформация полученных плазмид в электрокомпетентные клетки E.coli Neb-5α. Анализ полученных клонов. Лигирование вектора pBacPAK8 с фрагментом, содержащим кДНК PreS2-S региона вируса гепатита В осуществляли с применением ДНК-лигазы фага Т4 в минимальном объёме (10 мкл) в молярном соотношении 1:10 соответственно с помощью ДНК-лигазы фага Т4. Реакция проходила при 16°С в течение ночи. Далее лигазной смесью трансформировали клетки штамма Escherichia coli NEB-5a. Идентификацию клонов, содержащих РreS2-S ген проводили методом ПЦР с применением специфических праймеров к РreS2-S региону вируса гепатита В [10].

Рисунок 1. Схема конструирования плазмиды pBacPAK8-polh-PreS2-S

Результаты и обсуждение

Продукты ПЦР (амплификаты) анализировали при помощи электрофореза в 1%-ном агарозном геле (Рисунок 2). Фрагмент ДНК с молекулярной массой, соответствующей массе фрагмента ДНК, амплифицированного в контрольном образце по окончании реакции свидетельствовало о наличии вставки в исследуемой плазмиде. Таким образом, методом ПЦР были выявлены клоны, содержащие PreS2-S регион ДНК вируса гепатита В. Был проведен рестриктный анализ для того чтобы определить правильность ориентации вставки.

При помощи сравнительного анализа рекомбинантной плазмиды pBacPAK8-polh-Pres2-S и исходной векторной плазмиды pBacPAK8 по единичному сайту EcoRI, после электрофореза были выявлены фрагменты ДНК, масса которых соответствует теоретическим расчётам по физическим картам данных плазмид. Результаты анализа оценивали после проведения электрофореза в 0,7% агарозном геле (Рисунок 3).

При расщеплении вектора pBacPAK8-polh-Pres2-S рестриктазой EcoRI, была получена линейная форма плазмиды, соответствующая 6,496 т.п.н. Дальнейшей расщеплением плазмиды рестриктазой NotI были получены фрагменты с массами 5,5 и 0,9 т.п.н., которые свидетельствуют о правильной ориентации кДНК Pres2-S региона вируса гепатита В в рекомбинантной плазмидной ДНК pBacPAK8-polh-Pres2-S.

Рисунок 2. ПЦР анализ PreS2- гена

Рисунок 3. Рестрикционный анализ pBacPAK 8-polh-preS2-S (C) (EcoR >I/6496 п.н.)

Выводы

Таким образом, сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pBacPAK8-polh-PreS2-S размером 6496 п.н., содержащая Pres2-S регион вируса гепатита В под промотором гена полиэдрина. Данная плазмидная ДНК может быть использована как потенциальный кандидат для создания новых вакцин или диагностических средств, так как она содержит несколько антигенных детерминант.

Список литературы:
1. Всемирная организация здравоохранения/ [Электронный ресурс]- Режим доступа: https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-b
2. Патент UZ IAP 03178. Рекомбинантная плазмидная ДНК pBHEP-2, кодирующая PreS2-S регион вируса гепатита В человека (M-HBsAg), и способ ее конструирования. 31.10.2006.
3. Kost TA, Condreay JP, Jarvis DL. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat Biotechnol. 2005, 23: 567-575.
4. Ikonomou L, Schneider YJ, Agathos SN. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 2003, 62: 1-20.
5. A.R. Awan, M.Y. Zahoor, M.M. Javed, M.E. Babar, Z. Salem. Expression of PreS2/S antigen of Hepatitis B virus isolated from Pakistan in yeast cells. Pak. J. Bot. 2012, vol. 44, pp. 355-359.
6. Патент EP0339567 A1. Expression of Hepatitis B PreS 2 protein in methylotrophic yeasts. 25.04.1989.
7. Патент US5670630 A. Gregory P. Thill, San Diego, Calif. Expression of Hepatitis B S and Pres2 proteins in methylotrophic yeasts. 23.09.1997.
8. Патент UZ № IАР 03178. Рекомбинантная плазмидная ДНК рВНер-2, кодирующая preS2-S регион вируса гепатита В человека (M-HBsAg), и способ ее конструирования. 30.10.2002.
9. Michael R. Green, J. Sambrook. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2012. 2028 p.
10. John M.S. Bartlett, David Stirling. Methods in Molecular Biology: PCR Protocols, 2nd ed. 2003. Vol. 226. 525 p.