Подбор оптимальных условий индукции для получения наибольшего количества биомассы клеток дрожжей Pichia pastoris

АННОТАЦИЯ

Дрожжи Pichia pastoris являются одним из наиболее прогрессивных систем экспрессии, позволяющих получать рекомбинантные белки с большим выходом. В работе приводятся оптимальные условия культивирования дрожжей Pichia pastoris, позволяющие получать наибольшее количество биомассы клеток в течении краткого срока культивирования.

ABSTRACT

The yeast Pichia pastoris is one of the most progressive expression systems that allows the high yield production of recombinant proteins. This work presents the optimal conditions for the cultivation of Pichia pastoris yeast, allowing to obtain of the large amount of cell biomass during a short cultivation period.

Ключевые слова: дрожжевая система экспрессии, биомасса, культивирование, метанол, рекомбинантные белки, Pichia pastoris.

Keywords: yeast expression system, biomass, cultivation, methanol, recombinant proteins, Pichia pastoris.

Разработка новых, эффективных способов получения биологически активных белков (инсулин, интерфероны, гормоны роста, эритропоэтин, поверхностные белки для создания вакцин и мн. др.) которые в настоящее время могут быть получены только в живых системах методами генной инженерии является актуальной. Рынок биофармацевтических продуктов («красная» биотехнология) составляет в настоящее время более 314.2 млрд. долларов США и имеет тенденцию к дальнейшему росту быстрыми темпами [1]. Одной из наиболее прогрессивных систем экспрессии, позволяющих получить рекомбинантные белки является дрожжевая система Pichia pastoris. Pichia pastoris представляет собой метилотрофные дрожжи, способные метаболизировать метанол в качестве источника углерода. Как эукариот, обладает многими преимуществами высших эукариотических экспрессионных систем, таких как созревание белка и пост-трансляционные модификации, а также лёгкость при манипулировании как прокариоты E. coli или Saccharomyces cerevisiae. Накопление значительной биомассы при культивировании на недорогих питательных средах, отсутствие эндотоксинов и пирогенов, более высокий уровень синтеза рекомбинантных белков и способность синтезировать рекомбинантный белок в питательную среду [2-13] и др. особенности придают Pichia pastoris полезные качества при экспрессии гетерологических белков, делая её быстрее, проще и дешевле в промышленном использовании, по сравнению с другими эукариотическими системами экспрессии, например, таких как культура тканей млекопитающих. Как правило, ген кодирующий целевой рекомбинантный белок клонируется вместо функционального гена AOX1 и под его промотором, экспрессирующий фермент алкогольоксидазу, который отвечает за утилизацию метанола. Количество этого фермента составляет до 30% от общей суммы растворимых белков клетки [2]. Обычно культивирование дрожжей Pichia pastoris состоит из 3-х стадий и продлевается 96 - 120 ч., при этом количество биомассы клеток составляет до 450 г/л. В качестве источника углерода на первой и второй стадии культивирование используется глицерин в разных концентрациях, а синтез необходимого (рекомбинантного) белка индуцируется метанолом, который служит источникам углерода на третьей стадии [14-15]. В работе [15], авторы на первой стадии культивирования в питательную среду добавляют глицерин до 4% от общей массы в течении 18-24ч, а во второй стадии глицерин добавляется до 50% (18.15 мл/л/ч, ≥5 ч), пока влажная биомасса культуры не составит 180-220 г/л. На третьей стадии культивирования в биомассу добавляется метанол для индукции синтеза целевого белка в концентрации от 0.36 до 1.0% в течении ~5 часов. Далее кормление дрожжей продолжается добавлением метанола в культуру в конц. 1.0% в течении 70 часов. На этой фазе масса влажных клеток дрожжей достигает 350-450 г/л. Дальнейшее культивирование не приводить к увеличению биомассы. Итого весь этап культивирования занимает около 93 - 110ч.

Естественно, количество биомассы, получаемая при определённых условиях культивирования, является одним из основных факторов при получении рекомбинантных белков.

Целью настоящей работы являлся подбор оптимальных условий культивирования дрожжей Pichia pastoris для получения наибольшего количество биомассы клеток в течении краткого срока культивирования. Для этого мы проводили культивирование в 2-х стадиях.

Первая стадия культивирования. Ночную культуру (ОD при 600 нм =6.0), количество которого будет составляет 20% от общего объёма ферментационной среды переносят в ферментер, на среду BSM (таблица 1), содержащий растворы глицерина 5 % и сорбитола 0.4 %. Затем культивируют в течение ~20 часов до полного употребления глицерина. Кроме того, в питательную среду добавляют 14 мл PTM на 1/л среды BSM. После 10 ч от начала культивирования в ферментере добавляют метанол конц. 0.1-1.0%. рН среды =5.0 поддерживают добавлением 25% аммиака. Уровен растворимого кислорода (DO) в среде поддерживается не ниже чем 25%. В конце стадии количество влажных клеток составляет ~220-230 г/л.

Таблица 1.

Состав среды BSM

Вторая стадия культивирования. После 20 ч. культивирования на ферментёре (ОD при 600 нм =180), начинается добавление раствора метанола 10,2 мл/л/ч, который содержит 12 мл PTM (таблица 2) на 1 л этого раствора. В питательную среду дополнительно добавляют 12 мл/л/ч 33% раствора сорбитола. Процесс культивирования продолжается в том же порядке в течении 50 часов. Количество полученной биомассы составляет 450-460 г влажных клеток на 1 л питательной среды. Дальнейшее культивирование не приводит к увеличению биомассы дрожжей.

Таблица 2.

Состав раствора PTM

На первой стадии в культуру добавляли 5 % глицерина, 0.4 % сорбитола и культивировали в течении ~20 ч, добавлением метанола 0.1-1.0 % после 10 ч. На этой фазе культивирования масса влажных клеток составлял 220-230 г/л. На второй стадии культивирования в питательную среду каждый час продолжали добавлять 1.0% метанола и дополнительно 0.4% сорбитола в течении 50 ч. В конце этой фазы масса влажных клеток дрожжей составлял 450-460 г/л. Дальнейшее культивирование не привело к увеличению биомассы клеток.

Таким образом, нами подобраны оптимальные условия индукции рекомбинантных клеток дрожжей Pichia pastoris, в результате которого сокращается сроки культивирования с ~96 до ~70 часов, при котором биомасса культуры составляет до 450-460 г/л.

Список литературы:
1. Red Biotechnology Market (Application: Biopharmaceutical Production, Gene Therapy, Pharmacogenomics, and Genetic Testing; End User: Biopharmaceutical Industry, CMOs & CROs, Research Institutes, and Others) - Global Industry Analysis, Size, Share, Growth, Trends, and Forecast, 2019 - 2027. https://www.transparencymarketresearch.com/red-biotechnology-market.html
2. Ahmad M., Hirz M., Pichler H, Schwab H. Protein expression in Pichia pastoris: recent achievements and perspectives for heterologous protein production. Appl Microbiol Biotechnol. 2014, 98:5301–5317.
3. Cregg JM, Cereghino JL, Shi J, Higgins DR. Recombinant protein expression in Pichia pastoris. Mol Biotechnol. 2000, 16 (1):23-52.
4. Vogl T, Hartner FS, Glieder A. New opportunities by synthetic biology for biopharmaceutical production in Pichia pastoris. Current Opinion in Biotechnology. 2013, 24:1094–1101.
5. Bollok M, Resina D, Valero F, Ferrer P. Recent patents on the Pichia pastoris expression system: expanding the toolbox for recombinant protein production. Recent Pat Biotechnol. 2009, 3:192–201.
6. http://www.pichia.com/science-center/commercialized-products/
7. Gasser B, Prielhofer R, Marx H, Maurer M, Nocon J, Steiger M, Puxbaum V, Sauer M, Mattanovich D. Pichia pastoris: protein production host and model organism for biomedical research. Future Microbiol. 2013, 8:191-208.
8. Spohner SC, Quitmann H, Czermak P. Expression of enzymes for the usage in food and feed industry with Pichia pastoris. Journal of Biotechnology. 2015, 202:118.
9. Damasceno LM, Huang C-J, Batt CA. Protein secretion in Pichia pastoris and advances in protein production. Appl Microbiol Biotechnol. 2012, 93:31–39.
10. Shi X-L, Feng M-Q, Shi J, Shi Z-H, Zhong J, Zhou P. High-level expression and purification of recombinant human catalase in Pichia pastoris. Protein Expr Purif. 2007, 54:24–29.
11. Macauley-Patrick S, Fazenda ML, McNeil B, Harvey LM. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast, 2005, 22:249-270.
12. Idiris A, Tohda H, Kumagai H, Takegawa K. Engineering of protein secretion in yeast: strategies and impact on protein production. Appl Microbiol Biotechnol. 2010, 86: 403-417.
13. Cregg JM, et al. Expression in the yeast Pichia pastoris. Methods in Enzymology. 2009, 463:169.
14. Christian J. Production of Humanlike Recombinant Proteins in Pichia pastoris From Expression Vector to Fermentation Strategy. BioProcess International 2006, 22-30.
15. Pichia Fermentation Process Guidelines. 2002, Invitrogen. Version B 053002.