Антирадикальная активность некоторых полифенольных соединений

Введение. В патогенезе клетки важную роль играет повреждающее действие свободных радикалов и активных форм кислорода [7, 9]. Наиболее опасным фактором является воздействие продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Повышение уровня ПОЛ в клетке приводит к изменению внутри- и межклеточных взаимоотношений, расщеплению АТФ и аминокислот, деполяризации ДНК, изменению активности цитоплазматических ферментов, изменению осмотического давления, нарушению структуры мембран и функции клеток и в конечном итоге может приводить к гибели клеток.

В настоящее время коррекция в процесса ПОЛ повреждающая мембран клетку мембран антирадикальными и антиоксидантными средствами широко исследуется в фармакологии и медицине. В фармакологии используется коррекция процесса ПОЛ, где на клетках проводится интенсивное изучение биологических свойств флавоноидов — растительных пигментов, входящих в группу ОН-содержащих полифенолов [7, 8, 9]. В литературе АОА полифенолы связывают с их способностью хелатировать различные ионы металлов [1], так и непосредственно взаимодействовать с активными формами кислорода: О₂^· [2], OH-радикалами [3] и синглетным кислородом [4]. Кроме того, полифенолы могут взаимодействовать и/или связывать компоненты реакционной среды [5], что может приводить к искажению результатов. В этом отношении полезно использовать соединения, несущие свободную валентность, каковым является стабильные органические радикалы [6]. К примеру, орто-замещенные дифенолы имеют четыре электрона, которые могут восстанавливать различные радикалы [10]. В связи с этим антирадикальная активность полифенолов может быть связана непосредственно с их АОА. Поэтому сегодня актуальным является поиск новых эффективных антирадикалных и антиоксидантных препаратов из полифенолов.

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы является исследование антирадикальной активности некоторых полифенольных соединениями׃ выделенных из растения Euphorbia ferganensis B.Fedtch полифенола эуфорбин, выделенных из растения Geranium sanguineum полифенола гетасан, выделенных из растения Rhus coriaria полифенола ПС-5.

Мы в экспериментах исследовали антирадикальную активность (АРА) препаратов. Для этого нами была использована методика, основанная на способности антиоксидантов восстанавливать молекулы 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (ДФПГ) [10]. Мы изучали кинетику рекомбинации препаратов со стабильным радикалом ДФПГ. При добавлении полифенолов в спиртовой раствор ДФПГ происходит изменение окраски раствора, что соответствует переходу ДФПГ в нерадикальную форму. На рисунках (1; 2; 3) (экспериментальными точками) представлены кинетика изменения оптической плотности раствора ДФПГ при добавлении исследуемых нами трех препаратов (1-эуфорбин, 2-гетасан, 3-ПС-5).

Рисунок 1. Антирадикальная активность полифенола эуфорбина

Рисунок 2. Антирадикальная активность полифенола гетасана

Рисунок 3. Антирадикальная активность полифенола ПС-5

Из экспериментальных данных следует, что изучаемые соединения обладают высокой способностью к тушению свободных радикалов. Для количественной оценки антирадикальной активности мы использовали параметр t₅₀ – время необходимое для снижения исходной концентрации стабильных радикалов при реакции их с изучаемыми препаратами на 50% [10]. В реакции ДФПГ с полифенолами t₅₀ при 20 ^оС составляет для препарата 1 - 90 с (при соотношении основного вещества к ДФПГ 1:1), препарата 2 - 180 с (соотношение 1:1), для препарата 3 – 45 с (соотношение 1:1). Следовательно, по реакционной способности препарат 3 превосходит остальные препараты в 2 и более раз. Для сравнения можно привести данные работы [10], t₅₀ при 20^оС при эквимолярном соотношении унитиола к ДПФГ составляла 9,8 мин.

Анализ кинетических кривых показывает, что большая часть молекул ДФПГ восстанавливается в первые 5 минут реакции, в дальнейшем реакция восстановления проходит более медленно. Полученные данные согласуются с литературными [4]. Известно, что полифенолы, в отличие от низкомолекулярных соединений (a-токоферол, аскорбиновая кислота, низкомолекулярные фенолы и др.) обладают как быстро, так и медленно действующей АРА, возможно, поэтому кинетические кривые не укладываются на прямые в координатах для реакции второго порядка, как наблюдалось в работе [10]. По-видимому, в данном случае имеют место как прямые реакции исследуемых препаратов с молекулами ДФПГ с образованием неактивных продуктов (кинетика первого порядка), так и реакции, связанные со способностью молекул ДФПГ образовывать промежуточные донорно-акцепторные комплексы, которые реагируют с новыми молекулами ДФПГ (кинетика второго порядка) [10].

Если все соединения, входящие в состав препарата, или их часть обладают антирадикальной активностью по отношению к ДФПГ, то можно для каждого из них написать реакцию:

C_i + C_DPPG   2·C_DPPG* + C_DPPG** + C_i* ,

где C_i и C_DPPG – концентрации каждого индивидуальных полифенолов, входящих в состав экстракта, и ДФПГ;

2·C_DPPG* - промежуточного донор-акцепторного комплекса;

C_DPPG** - мономера восстановленной молекулы ДФПГ;

C_i* - продукта полифенола после передачи электронов.

Тогда можно написать уравнение восстанов­ления ДФПГ в виде:

,

где i относится к одному из индивидуальных полифенолов.

Суммарную реакцию параллельных процессов взаимодействия суммы полифенолов с ДФПГ можно представить в следующем виде:

,

где C_DPPG концентрация ДФПГ, k1_eff и k2_eff -эффективные константы реакции первого и второго порядка.

В результате построения кривой нелинейной регрессии и решения приведенного уравнения и экспериментальных данных найдены k1_eff и k2_eff. Погрешность суммы отклонений аналитической кривой и экспериментальных точек не более чем 10^-4. Величины k1_eff и k2_eff позволяют сравнить антирадикальные активности изучаемых препаратов.

Значения рассчитанных на основе нелинейной регрессии эффективных констант реакции k1_eff и k2_eff,

Как видно, наиболее эффективными антирадикальными свойствами обладает препарат 3, для которого константы первого и второго порядка наибольшие: 4,53 10^-4 (мин^-1) и 2,1 (М^-1× мин^-1), соответственно.

Полученные значения констант k2_eff скоростей реакций ДФПГ с комплексными препаратами выше, чем для низкомолекулярных антиоксидантов, так, например, для унитиола эта константа составляет всего 0,37 (М^-1× мин^-1) [9].

Таким образом, скорость реакции изученных препаратов с ДФПГ различна. Все изученные препараты обладают высокой антирадикальной активностью по сравнению с известными антиоксидантами.