Бакуловирусная система экспрессии, как безопасная и эффективная система для получения рекомбинантных белков

АННОТАЦИЯ

На сегодняшний день для получения рекомбинантных белков успешно используются системы экспрессии «бакуловирусы/клетки насекомых» так как рекомбинантные белки, получаемые в этих системах по своим функциональным параметрам неотличимы от их природных аналогов и характеризуются высоким выходом. Рекомбинантные бакуловирусы получаемые на основе данного вируса и клетки/личинки насекомых в качестве биореактора позволяют получить целевой белок безопасным и эффективным способом.

ABSTRACT

Today, for the production of recombinant proteins, baculovirus / insect cell expression systems have been successfully used, since the recombinant proteins produced in these systems are indistinguishable from their natural counterparts in their functional parameters and are characterized by high yield. Recombinant baculoviruses obtained on the basis of this virus and insect cells / larvae as a bioreactor make it possible to obtain the target protein in a safe, effective way.

Ключевые слова: АсMNPV - вирус множественного ядерного полиэдроза (калифорнийской совки), ВЯП – вирус ядерного полиэдроза, GFP – зеленый флуоресцентный белок, FBS – эмбриональная телячья сыворотка, БОЕ – бляшкообразущие единицы.

Keywords: АсMNPV - Autographa  californica Multiple Nuclear Polyhedrosis, NPV – nuclear polyhedrosis virus, GFP- Green  Fluorescent  Protein, FBS- Foetal Bovine Serum, BOE - plaque forming units.

Введение

На сегодняшний день бакуловирусная векторная система успешно применяется для доставки генетической информации в клетки эукариот in vitro и ее использование для доставки генов in vivo продолжает расширяться. Векторы на основе бакуловирусов находят все большее применение в фундаментальной и прикладной биологии, в биомедицине, для разработок, направленных на создание методов диагностики, вакцинации. В связи с этим является актуальным показать, что вирусы насекомых высокоспецифичные и безопасны для человека и сельскохозяйственных животных, а также  не загрязняют среду обитания.

Из литературных данных известно, что бакуловирусы представляют довольно обширное семейство вирусов, поражающих исключительно членистоногих, преимущественно представителей класса Насекомые (Insecta) отряда Чешуекрылые (Lepidoptera) [1]. Бакуловирусы характеризуются рядом преимуществ, например, отсутствием выраженной цитотоксичности в клетках млекопитающих in vitro даже при введении больших (500 БОЕ) доз вируса, что свидетельствует о безопасности бакуловирусных векторов [2]. Бакуловирусы не реплицируются в клетках млекопитающих [3], способны трансдуцировать широкий спектр типов клеток и тканей [6], и, благодаря структуре генома и вирусных частиц, включать большие (до 30 тыс.н.п.) фрагменты гетерологичной ДНК [4]. Показано, что при трансдукции бакуловируса не изменяется потенциал дифференцировки и спектр поверхностных маркеров клеток [5].

Однако ранее в экспериментах для доставки генов в клетки млекопитающих, где были использованы векторы на основе вирусов ядерного  полиэдроза AcMNPV [6], было показано, что экспрессия генов в клетках млекопитающих в составе бакуловирусов выявлялась только при встраивании генов под контроль цитомегаловирусного (CMV) IE-промотора и промотора из вируса саркомы рауса (RSV) [7,10], CAG-кассета, включающая IE-энхансер цитомегаловируса, промотор гена β-актина цыпленка и сигнал полиаденилирования гена β-глобина кролика, также эффективно запускает экспрессию во многих типах клеток и проявляет себя более сильным регулятором, чем промоторы CMV и RSV [8].

Известно, что в клетках насекомых собственные бакуловирусные гены транскрибируются, в клетках же млекопитающих транскрибируются только гены, находящиеся под контролем промотора млекопитающих. В клетках насекомых вирусная ДНК реплицируется и упаковывается в нуклеокапсиды. В клетках млекопитающих репликации не происходит и вирусное потомство не образуется [9,10].

Целью данной работы является, определение безопасности бакуловирусов для человека и животных, для этого была проведена трансфекция с использованием реагента ExGen 500.

Материалы и методы.

Для проведения данной работы нами были выбраны перевиваемые клеточные линии Spodoptera frugiperda Sf-9 и Bombyx mori BMN1. Для трансфецирования выбран рекомбинантный бакуловирус Autographa californica – rAcMNPV-EGFP Δ egt, который  входит в I группу ВЯП и относится к типу вирусов множественного ядерного полиэдроза.

Рекомбинантный бакуловирус. AcMNPV широко изучается на молекулярном уровне, в основном, из-за своей эффективной репликации в культуре клеток насекомых. В последнее время AcMNPV все чаще используется в качестве эффективной системы экспрессии различных белков и других веществ биологического и медицинского назначения [11]. Также AcMNPV является очень привлекательным в качестве биологического агента контроля численности насекомых-вредителей с/х культур, что было показано на ряде насекомых, включая хлопковую совку, табачную совку, непарного шелкопряда, капустную моль и многих других [12].

С бакуловирусными векторами экспрессии, сконструированными главным образом на основе вируса Autographa californica MNPV, наиболее часто применяются клеточные линии Spodoptera frugiperda – линия Sf-21 и ее клональная производная - линия Sf-9 [13].

Клеточные культуры. Клеточные линии Spodoptera frugiperda (Sf-9 и Sf-21) и Bombyx mori (BMN1) широко применяются в Бакуловирусных системах экспрессии. Первичные культуры Sf были получены из незрелых яичников куколок травяной   совки Spodoptera frugiperda в Лаборатории Патологии Насекомых USDA (IPLB) в Beltsville, Maryland методами описанными подробно Goodwin [14]. Клеточная линия Spodoptera frugiperda Sf9 является субклоном  клеточной линии IPLB-SF-21-AE [15]. Первичные культуры  тутового шелкопряда Bombyx mori (BMN1) были получены из среднего кишечника личинки.

Клеточная линия клеток Sf-9 и BMN1 поддерживается в нашей лаборатории путем еженедельного субкультивирования. Клетки содержатся при 26⁰С на питательной среде для клеток насекомых  Грейса (Grace’s Insect Cell Culture  Medium), содержащей 10% термически инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки FBS (Sigma).

Фибробласты - наиболее распространенные и функционально значимые клетки рыхлой соединительной ткани. Фибробласты участвуют в заживлении ран, мигрируя на места повреждений. Первичная  культура  фибробластов, получена из мягких тканей 14-дневных  эмбрионов мышей методом  ферментативной  дезагрегации ткани. Линии клеток культивировали в среде DMEM (Sigma) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки FBS (Sigma), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37 °с в CO₂-инкубаторе.

Трансфекция с использованием реагента ExGen 500. В лунки 24 луночного культурального планшета вносили клетки, по 1 мл, из расчета концентрации 2´10⁵ клеток/мл Sf-9, 2´10⁵ клеток/мл BMN1, клетки  фибробластов рассевали  в  6-ти  луночные  плашки  в  концентрации 2´10⁵ клеток на лунку. В 3 стерильные пробирки наливали по 100 мкл 150 мМ раствора NaCl. Добавляли в каждую пробирку по 20 мкл ДНК (0,1 мкг/мкл) и перемешивали смесь. Затем инкубировали пробирки в течение 5 минут при температуре 72°С. После пробирки остужали  и добавляли в каждую по 10 мкл реагента ExGen 500. Смесь снова перемешивали, с помощью Vortex, в течение 10 секунд и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. В каждую лунку с клетками добавляли по 100 мкл смеси ДНК с трансфецирующим реагентом. Перемешивали смеси в лунках осторожным встряхиванием планшеты, заклеивали лентой и инкубировали в течение 3-5 дней.

Определение GFP- специфичной флуоресценции в клетках. Определение трансфецированных проводили по интенсивности свечения маркерного гена GFP путем визуализации GFP-специфической флуоресценции (рис 1).

Результаты и обсуждение.

Выявление экспрессии репортерного гена GFP в анализируемых  клетках. Клетки Spodoptera frugiperda Sf-9, трансфецированные рекомбинантным бакуловирусом rAcMNPV-EGFP Δegt при помощи реагента ExGen 500, в ультрафиолетовом спектре излучали GFP-специфическую флуоресценцию, тогда как клеточная культура фибробластов, а также клеточная линия Bombyx mori  BMN1  , трансфецированные  бакуловирусом rAcMNPV-EGFP Δegt, не обладали  таким свойством, и лунки планшета оставались темными, что свидельствует о том, что проникновение рекомбинантного ДНК не произошло.

Таким образом, экспрессия белка GFP свидельствует о том, что проникновение рекомбинантного ДНК происходит только в клетки восприимчивых к данному бакуловирусу.

В результате нами было показано, что восприимчивость различных видов клеток к ДНК бакуловируса высокоспецифична.

Выводы. Полученные данные  свидетельствуют, что одним из преимуществ бакуловирусов является то, что эта группа вирусов инфицируют только членистоногих, а каждый индивидуальный штамм палочковидного вируса обычно инфицирует только один или несколько видов насекомых. Также известно, что человека отсутствует врожденная гуморальная и клеточная иммунная память по отношению к бакуловирусам. Таким образом, они не представляют угрозы ни для окружающей среды, ни для человека и могут быть использованы без вреда для полезных видов насекомых. Данный вирус не является вредным для клеток человека , и именно поэтому он стал объектом интенсивных исследований в области генной терапии.

Бакуловирусы могут быть использованы в качестве биоинсектицидов против значительного количества вредных видов благодаря их высокой вирулентности, специфичности и пролонгированной активности за счет эпизоотий. Следовательно, бакуловирусная система экспрессии на сегодняшний день является безопасной и эффективной системой экспрессии для получения сложных рекомбинантных белков.

Список литература:
1. Белжеларская С.Н. Бакуловирусная система экспрессии в клетках насекомых. Молекулярная биология том 36 №3, 2002, стр 281-292.
2. Kenoutis C., Efrose R.C., Swevers L. et al. Baculovirus-mediated gene delivery into Mammalian cells does not alter their transcriptional and differentiating potential but is accompanied by early viral gene expression // J. Virol. –2006. – Vol. 80. – P. 4135–4146.
3. Condreay J.P., Witherspoon S.M., Clay W.C., Kost T.A. Transient and stable gene expression in mammalian cells transduced with a recombinant baculovirus vector // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1999. – Vol. 96. – P. 127–132.
4. Fujita R., Matsuyama T., Yamagishi J. et al. Expression of Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus genes in mammalian cells and upregulation of the host beta-actin gene // J. Virol. – 2006. – Vol. 80. – P. 2390–2395.
5. Chuang C.K., Wong T.H., Hwang S.M. et al. Baculovirus transduction of mesenchymal stem cells: in vitro responses and in vivo immune responses after cell transplantation // Mol. Ther. – 2009. – Vol. 17. – P. 889–896.
6. Hofmann C., Sandig V., Jennings G. et al. Efficient gene transfer into human hepatocytes by baculovirus vectors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA – 1995. – Vol. 92, № 22. – P. 10099-10103.
7. Boyce F.M., Bucher N.L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. – Vol. 93, № 6. – P. 2348–2352.
8. Shoji I., Aizaki H., Tani H., et al. Efficient gene transfer into various mammalian cells, including non-he-patic cells, by baculovirus vectors // J. Gen. Virol. – 1997. – Vol. 78, № 10. – P. 2657–2664.
9. Matsuura Y., Shoji I., Yap C..C., Tani H., Ishii K.,Miyamura T. 1997. Gene transfer into mammalian cells by baculovirus vector and its applications. Virus. 47, 247–256.
10. Condreay J.P., Witherspoon S.M., Clay W.C.,KostT.A. 1999. Transient and stable gene expression in mammalian cells, transducted with a recombinant baculovirus vector. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 127–132
11. Gershburg, E., Rivkin, H., Chejanovsky, N., 1997. Expression of the Autographa californica nuclear polyhedrosis virus apoptotic suppressor gene p35 in nonpermissive Spodoptera littoralis cells. J. Virol. 71, 7593_/7599.
12. Granados R.R., Federici B.A. 1986. The Biology of baculoviruses. Vol.1: Biological properties and molecular biology. CRC Press, Inc., Boca Raton, FL.
13. O’Reilly D.R., Miller L.K., Luckow V.A. 1992. Baculovirus expression vectors: a laboratory manual. CRC Press, Inc., Boca Raton, FL.
14. Vaughn, J.L., Goodwin, R.H., Tompkins, G.J., McCawley, P., 1977. The establishment of two cell lines from the insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae). In Vitro 13, 213–217.
15. O’Reilly D.R., Miller L.K., Luckow V.A. 1992. Baculovirus expression vectors: a laboratory manual. CRC Press, Inc., Boca Raton, FL.