Качественное исследование фенольных соединений и флавоноидов надземной части растения Urtica dioica L

ВВЕДЕНИЕ

Крапива двудомная (Urtica dioica L., сем. Urticaceae-крапивные) - одно из самых популярных лекарственных растений в традиционной и народной медицине [1]. Это многолетнее травянистое растение высотой от 60 до 100 сантиметров. Оно произрастает почти по всей европейской части России и Центральный Азии [2]. Препараты из листьев крапивы используют в качестве кровоостанавливающего, противовоспалительного, противоопухолевого, а также желчегонного средства [3-5]. Лекарственные препараты на основе крапивы двудомной «Простафортон» и «Базотон» применяются для лечения аденомы предстательной железы и простатита, которые являются одними из наиболее распространенных заболеваний у мужчин [6].

Полезные свойства лекарственных растений зависят от содержания в них так называемых действующих веществ, такие как, макро- и микроэлементы, витамины, флавоноиды, сапонины, алкалоиды, эфирные масла, органические вещества. Настой, жидкий экстракт, порошок и сок листьев крапивы применяют при острых и хронических энтероколитах при кишечных, маточных кровотечениях и в качестве поливитаминного и мочегонного средства [7].

У крапивы двудомной наиболее используемой частью являются листья. В листьях крапивы двудомной содержатся витамины К, В2, С, флавоноиды, каротин, пантотеновая кислота, фитонциды, белки, сахара, хлорофилл, дубильные вещества, кремниевая и муравьиная кислоты, макро- и микроэлементы (железо, ванадий, марганец, хром, медь, алюминий) [8].

В качестве лекарственного сырья используют как отдельные части растения, так и все растение в целом, с учетом антропогенных воздействий. На химический состав лекарственного растения существенное влияние оказывает состояние окружающей среды, место произрастания и природно-климатические условия [9].

Исходя из вышеизложенного изучение, в сравнительном аспекте, минерального и химического состава вегетативных органов растения Urtica dioica L., произрастающего в горных районах Республики Узбекистана является актуальной задачей.

Целью работы является качественное сравнительное химическое исследование растения Urtica dioica L., произрастающего в горных районах Джизакской области.

Объектом исследования служила крапива двудомная (Urtica dioica L.), собранная в период цветения, то есть в апреле месяце, 2018 года. Место отбора, проб высокогорные районы Республики Узбекистан (1500-2000м).

МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ:

150 г сырья высушивали до постоянного веса в сушильном шкафу и измельчали до размера не более 2- 4 миллиметра. Высушенное сырьё экстрагировали в 90% этиловом спирте, в соотношении сырья и экстрагента 1:10. Экстракция проводилась на водяной бане, снабженной обратным холодильником в течение 12 часов при температуре 40-50 ⁰С. Процесс экстракции повторялся 5-6 раз, до исчезновения цвета экстрагента. Далее объединенные экстракты (этиловый спирт) концентрировали на роторном испарителе до остатка 1/10 части растворителя. Затем в концентрат заливали 150 мл горячей воды (водное извлечение) и охлаждали до комнатной температуры. Для извлечения остатка липофильных веществ и хлорофилла, водное извлечение экстрагировали хлороформом в соотношении 1:2. Образующиеся расслоенные части растворителей разделяли на делительной воронке. Очищенное водное извлечение 2 раза фракционировали сначала эфиром, этилацетатом и н-бутанолом. Диэтил эфирную фракцию перемешивали в соотношении растворителей 1:2 и разделили на делительной воронке. После этого этилацетатные и бутанольные фракции в соотношении 1:2 разделены таким же способом, как и диэтил эфирная фракция. Все вышеперечисленные фракции концентрировали на роторном испарителе до остатка 1/10 [10]. Полученные экстракты идентифицировали методом двухмерной бумажной хроматографии (Filtrak FN/16) в системе (III), (IV). Высушивали и обрабатывали раствором гексацианоферрата (III) калия (растворённой в 70% этиловом спирте). После обработки все пятна приобретают жёлто-зелёную флюоресценцию. По величине Rf и характеру флюоресценции идентифицированные вещества были экстрагированы из хроматографической бумаги и дальнейший анализ проводили методом хромато-масс-спектрометрии. По молекулярному распаду анализируемых веществ были идентифицированы индивидуальные соединения.

Хроматографические условия были подобраны следующим образом:

Подвижная фаза (в градиенте с ацетонитрилом):

0,5 мин. 0% В;

0,5-10 мин. 60% В;

10-12 мин. 85% В;

12-13 мин. 90% В;

13-14 мин. 0% В;

Температура колонки была 35ºC.

Масс-спектрометрию с ионизацией электронным ударом (HESI-II) проводили в следующих условиях:

Спрей напряжение – 4000 V, при мониторинге отрицательных ионов;

Температура испарителя – 250 ºC,

Давление газа оболочки – 20 psi,

Давление вспомогательного газа – 10 psi ;

Температура капилляра – 100 ºC;

Давление столкновения– 1.5 mTorr;

Энергия ионизации – 20 еV.

Для идентификации флавоноидов использована ТСХ хроматография на пластинках марки «SILUFOL». Системы растворителей для ТСХ: хлороформ: метанол 3:1 (I) или хлорофором: этанол 9:2 (II). В качестве проявителя применяли пары йода. Для бумажной хроматографии была использована хроматографическая бумага Filtrak FN/16. Для колоночной хроматографии применяли силикагель (L) размером частиц 40\100. А для определения молекулярных масс флавоноидов Urtica dioica использовалась ультра высокоэффективная жидкостная хроматография - масс спектрометрии (УВЭЖХ-MС/MС). УВЭЖХ Ultimate 3000, Thermo Fisher Scientific (США), снабженный автоматическим пробоотборником, колонка Hypersil GOLDaQ 100мм x 2.1мм, размер частиц 1,9мкм. В качестве подвижной фазы использована ультрачистая вода, подкисленная 0,01% муравьиной кислотой (А) и ацетонитрил (В), скорость потока 0,1 мл/мин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для исследований были использованы стебли и листья растения Urtica dioica L.. Качественные реакции на фенольные соединения проводили по общепринятой методике [10]. Общая схема выделения фенольных соединений из растения Urtica dioica L. приведена на схеме 1.

Рисунок 1. Схема выделения фенольных соединений крапивы двудомной

Измельченное до 2- 4 мм сырьё высушивали под навесом. Экстракцию проводили в соотношении сырья и экстрагента 1:10. В качестве экстрагента использовали этиловый спирт 90%, при температуре 40-50⁰С. Полученный экстракт концентрировали на роторном испарителе и остаток растворяли в горячей воде с последующей декантацией хлороформом. Далее суммы флавоноидов извлекали последовательно, с использованием диэтилового эфира, этилацетата и н-бутанола [7]. Полученные экстракты концентрировали в роторном испарителе. Концентраты экстрактов идентифицировали методом двухмерной бумажной хроматографии. Полученные данные приведены в таблице 1. 

Таблица 1.

Некоторые физико-химические показатели экстрактов Urtica dioica L.

Система: бутанол:уксусная кислота:вода (4:1:5) (III), 2%-ная уксусная кислота (IV)

Проведенные исследования показали, что листья и стебли крапивы двудомной содержат флавоноиды, которые также были изучены методом тонкослойной хроматографии и сопоставлены с литературными данными [10].

По литературным данным разделение и идентификация проводилась методом колоночной хроматографии на силикагеле марки 100/160 [9]. Для определения химических структур выделенных индивидуальных соединений использовали метод хромато-масс-спектрометрии [9]. Следует отметить, что в нашем случае использование силикагеля марки 100/160 при колоночной хроматография оказалось не эффективной. Поэтому нами был использован силикагель (L) марки 40/100, при которой было получено кристаллическое вещество с R_f 0,65 в системе (I).

Результаты проведенных качественных анализов дают возможность предположить о наличии в растениях Urtica dioica L. следующих флавоноидов: флавонолы, флавононы и гликозиды флавоноидов.

Для идентификации флавоноидов методом бумажной хроматографии разработан оптимальный состав растворителей и показано, что оптимальной системой растворителей является система III. Методом бумажной хроматографии идентифицирована эфирная фракция. После обработки их раствором гексацианоферрата (III) калия (в 70% этиловом спирте), обнаружено вещество со значением R_f 0,61, с характерным молекулярным ионом m/z 223, которое соответствует изофлаванону (3-фенилхромен-4-он). Также идентифицировано вещество со значением R_f 0,73 с молекулярной массой m/z 270, которому соответствует 4`,5,7- тригидроксифлавон. Вещество со значением R<sub>f</sub> 0,88 и с характерным молекулярным ионом m/z 242, которое соответствует веществу 5,6,7-тригидроксифлавон. Следующее вещество с R<sub>f</sub> 0,95 с характерным молекулярным ионом m/z 340 соответствует 5,7-дигидрокси-2-(4-гидроксифенил). Вещество со значением R<sub>f</sub> 0,73 с молекулярным ионом m/z 448, идентифицировано как 3,3`,4`,5,7-пентагидроксифлавон. Вещество с R<sub>f</sub> 0,41 идентифицировано как гиперозид, которое характеризуется молекулярным ионом m/z 464, соответствующее к гиперину. В литературных источниках показано, что эфирная фракция растения Urtica dioica L. содержит следующие флавоноиды: резорцин, эфир коричной кислоты, эфир галловой кислоты, и фенилпропановая кислоты [10]. В нашем случае эти вещества были определены и кроме этого были идентифицированы 3-фенилхромен-4-он, 4`,5,7 тригидроксифлавон, 5,6,7 тригидроксифлавон, 5,7-дигидрокси 2-(4-гидроксифенил), 3,3`,4`,5,7 пента-гидроксифлавон и гиперин в эфирной фракции исследуемого растения.

В этилацетатной фракции наблюдалось вещество со значением R_f 0,66 и с характерным молекулярным ионом m/z 222, которое идентифицировано как 2-фенил-4-бензопирен. Также определено вещество со значением R_f 0,72 с молекулярным ионом m/z 302, которое по молекулярному распаду соответствует кверцетину. Следующее вещество с R_f 0,84 и характерным молекулярным ионом m/z 464, которое согласно молекулярному распаду соответствует гиперину. Также определено вещество со значением R_f 0,58 с молекулярной массой m/z 270, которое соответствует апигенину. По литературным данным показано, что этилацетатная фракция растения Urtica dioica L содержит следующие флавоноиды: гиперозид m/z 464 и кверцетрин m/z 302 [10]. В нашем случае кроме них были обнаружены 2-фенил4-бензопирон, кверцетин, гиперин и апигенин.

В н-бутанольной фракции растения идентифицировано вещество со значением R_f 0,68 с молекулярным ионом m/z 302, соответствующий кверцетину, также определено вещество со значением R_f 0,41 и молекулярной массой m/z 270, которое представляет собой апигенин.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ:

Сравнительный анализ полученных результатов показал, что флавоноидный состав надземной части растения Urtica dioica произрастающего в горных районах Республики отличается от данных, представленных в литературе, что по всей вероятности, объясняется различием почвенно-климатических условий произрастания.