Сравнительная характеристика выхода глутатиона из различных типов клеток

Глутатион (GSH) – это трипептид (γ-глутамилцистеилглицин), который является основным свободным тиолом и низкомолекулярным антиоксидантом в большинстве живых клеток. Внутриклеточный глутатион участвует во многих биологических процессах, таких как восстановление ксенобиотиков, устранение гидропероксидаз и поддерживает восстановленное состояние белковых сульфогидрильных групп в цитозоле. Концентрация внутриклеточного глутатиона в большинстве типов клеток составляет около 1- 2 мМ. Небольшое количество глутатиона может находиться также и в межклеточной среде. В интерстициальной жидкости концентрация глутатиона оставляет несколько мкМ, а в плазме эта величина обычно вдвое выше. Хотя роль внутриклеточного глутатиона в поддержании иммунного статуса организма хорошо известна, роль внеклеточного глутатиона и пути его выхода из лимфоидных клеток практически не изучены.

Лимфопоэтические клетки-предшественники зарождаются в костном мозге, откуда вместе с кровотоком они поступают в тимус. Здесь они пролиферируют и подвергаются процессу позитивной и негативной селекции. Большая часть погибает путем апоптоза, и только зрелые клетки, имеющие на своей поверхности Т-рецептор, но не реагирующие на собственные антигены, выходят в кровоток в качестве зрелых Т-лимфоцитов [7]. В настоящее время известно, что как пролиферация, так и апоптоз требуют наличия эффективной системы регуляции клеточного объёма, который претерпевает значительные изменения при этих процессах. Ранее было показано, что лимфоциты тимуса обладают эффективной системой регуляторного уменьшения объема в условиях гипоосмотического стресса [1,4,5,6,7,9,10]. Является ли осмотический стресс сигналом для выброса глутатиона из тимоцитов? В настоящей работе мы впервые продемонстрировали, что при осмотическом набухании тимоцитов происходит массовый выброс глутатиона во внеклеточную среду.

В наших экспериментах, нормальный раствор Рингера содержал (мМ): 135 NaCl, 5 KCl, 10 HEPES, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 5 глюкозы, pН 7,4 (290±2 мОсм/кг Н₂О). Гипотонические растворы различной осмоляльности (от 40 до 290 мОсм/кг Н₂О) готовились путем разведения нормального раствора Рингера в различных соотношениях буфером следующего состава (мМ): 5 KCl, 10 HEPES, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 5 глюкозы, pН 7,4 (40±2 мОсм/кг H₂O). Опыты проводили на 6-8 недельных белых крысах линии Вистар. Выделение тимоцитов проводили по стандартной методике как описано ранее [4,6,7] и их жизнеспособность определяли по исключению трипанового синего. Конечную суспензию, содержащую не более 5% погибших клеток, хранили в растворе Рингера и использовали в течение 3-5 ч.

Количественное колориметрическое определение глутатиона проводили по методу, основанному на окислении GSH до дисульфида GSSG при взаимодействии с реагентом 5,5′-дитиобис 2-нитробензойной кислотой (5,5′-dithiobis 2-nitrobenzoic acid, DTNB), который, в свою очередь, восстанавливается до 5-тио-2-нитробензойной кислоты (5-thio-2-nitrobenzoic acid, TNB). Продукт реакции (TNB) имеет жёлтую окраску и определяется фотометрически при λ 412 нм [2]. В присутствии глутатионредуктазы и НАДФН происходит непрерывная рециклизация GSSG, который при этом восстанавливается до исходного GSH. Поэтому, в комбинированной реакции глутатион играет роль катализатора в общей реакции восстановления DTNB до TNB за счет НАДФН, скорость которой прямо пропорциональна концентрации глутатиона в микромолярном диапазоне.

В наших экспериментах мы зарегистрировали заметные количества глутатиона во внеклеточной среде даже в отсутствии стимуляции при инкубации тимоцитов в нормальных изоосмотических условиях. Базовый выход глутатиона составил 0,29 ± 0,07 мкМ при концентрации клеток в суспензии, равной 12,5 млн/мл и 1,11 ± 0,04 мкМ в суспензии, содержащей 100 млн/мл клеток после 10-мин инкубации. В условиях гипоосмотического стресса (147 мОсм/кг H₂O) мы наблюдали резкое увеличение скорости выхода глутатиона, которая составила 1,23 ± 0,09 мкМ и 6,37 ± 0,04 мкМ в суспензии с концентрацией клеток 12,5 млн/мл и 100 млн/мл после 10-мин инкубации, соответственно. Зависимость содержания глутатиона во внеклеточной среде от числа клеток в суспензии была близка к линейной как при нормальных изотонических условиях, так и в условиях гипоосмотического стресса, как это показано на рисунке 1А. Это является доказательством того, что именно тимоциты являются источником глутатиона во внеклеточной среде в наших экспериментальных условиях.

Кинетика выхода глутатиона заметно отличалась в изотонических и гипотонических условиях. Так, если базовый выход глутатиона в нормальных условиях плавно увеличивался во времени, то при гипоосмотическом стрессе мы наблюдали, резкое скачкообразное увеличение содержания глутатиона в среде в начальный момент времени, которое затем сменялось плавным ростом до примерно постоянного уровня, которое достигалось после 20-минутной инкубации (рис. 1Б).  

Рисунок 1. Выход глутатиона в нормальной изотонической среде

(светлые символы) и в условиях гипоосмотического стресса (147 мОсм/кг Н₂О; тёмные символы) в зависимости от концентрации клеток в суспензии (А: время инкубации 10 мин) и времени (Б: концентрация клеток 100 млн/мл). Эксперименты проведены при 25^оС. Во всех случаях Р < 0,05 относительно нормы (контроль)

Такая двухфазная кинетика, по-видимому, может свидетельствовать о наличии, по крайней мере, двух механизмов выхода глутатиона из тимоцитов с различными кинетическими параметрами.

Изложенные выше результаты, свидетельствуют о массовом выбросе глутатиона из тимоцитов во внеклеточную среду как в нормальных условиях, так и при гипоосмотическом стрессе. Присутствует ли аналогичная система регулируемого выброса глутатиона в других типах клеток? Для ответа на этот вопрос мы исследовали выход глутатиона из нормальных человеческих эритроцитов после 20 минутной инкубации в среде с различной тоничностью при варьировании числа клеток в суспензии. Было установлено, что концентрация глутатиона во внеклеточной среде в суспензии эритроцитов с концентрацией 100 млн/мл составляет 0.57±0.14 мкМ (n=5) при изотонических условиях и 1,33±0.11 мкМ (n=5) в гипоосмотической среде. Концентрация внеклеточного глутатиона росла линейно с ростом числа клеток в суспензии в диапазоне от 100 млн/мл до 1 млрд/мл (Рис. 2).  

Рисунок 2. Выход глутатиона из красных кровяных клеток человека в нормальном состоянии
(290 мОсм/кг Н₂О) и в условиях гипоосмотического стресса (147 мОсм/кг Н₂О)

В расчете на одну клетку, скорость выхода глутатиона из эритроцитов составила в нормальной среде 0,09х10^–15 г/мин, а и при гипоосмотическом стрессе 0,2х10^–15 г/мин. Для сравнения этих величин со скоростью выброса глутатиона из тимоцитов мы пересчитали данные, приведенные на рисунке 1, в расчете на одну клетку. Анализ данных показал, что скорость выхода глутатиона из тимоцитов составляет 0,34х10^–15 г/мин и 1,96х10^–15 г/мин в нормальных и гипоосмотических условиях, соответственно. Сравнение этих величин с данными для эритроцитов показывает, что скорость выброса глутатиона из красных кровяных клетках примерно в 4 раза медленнее, чем из тимоцитов в нормальной среде и практически в 10 раз медленнее в условиях гипоосмотического стресса. Хотя скорость выброса глутатиона из эритроцитов оказалась достаточно низкой по сравнению с тимоцитами, однако, учитывая то, что эритроциты составляют основную массу форменных элементов крови, этой скорости, по-видимому, вполне достаточно для того, чтобы обеспечить физиологический уровень глутатиона в плазме. Высокая скорость выхода глутатиона из тимоцитов может свидетельствовать о важной роли этой молекулы в физиологических процессах, протекающих во внеклеточной среде тимуса.

На следующем этапе экспериментов мы исследовали выход глутатиона из раковых клеток меланомы в культуре (линия КМЛ). Клетки выращивались в стеклянных карелях при температуре 37⁰С до конфлуэнтного состояния (т.е. до формирования клеточного монослоя). В этих экспериментах концентрация внеклеточного глутатиона монотонно росла во времени (Рис. 3) и после 40 минут инкубации составила 0,66±0,06 мкМ (n=5) в нормальных условиях и 1,26 ± 0,012 мкМ (n=5) при гипоосмотическом стрессе. Полученные результаты показывают наличие механизма выхода глутатиона в раковых клетках меланомы и о его возможной роли в процессе канцерогенеза.