Вазорелаксантное действие дитерпеноидного алкалоида 6–о–бензоилгетератизина на функциональную активность гладкомышечных клеток аорты крысы

Известно, что патогенез большинства кардиоваскулярных заболеваний прямо связан с дисфункциями в работе различных типов ион–транспортных систем гладкомышечных клетки (ГМК) сосудов. В связи с этим, изучение молекулярных механизмов регуляции функциональных свойств ГМК в физиологических/патологических условиях является актуальной проблемой современной физиологии и биофизики [1; с.767–772; 2; с.568–573; 3; c.1039–1047; 4; 145–170].

Цель работы – изучение влияния С₁₉–нордитерпеноидного алкалоида 6–О–бензоилгетератизина, выделенного из растения Aconitum zeravshanicum на функциональную активность ГМК аорты крысы (рис. 1).

Рисунок 1. Химическая структура дитерпеноидного алкалоида 6–О–бензоилгетератизина [5; с.16]

Материалы и методы. Эксперименты проводились на препаратах, представляющих собой кольца шириной ~3–4 мм, выделенных из аорты белых беспородных крыс (150–200 гр) и помещенных в специальную камеру (5 мл), перфузируемую физиологическим раствором Кребса–Хензелайта. Эксперименты выполнялись в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению биомедицинских исследований с использованием животных», принятыми Международным советом медицинских научных обществ (CIOMS) в 1985 г. В эксперментах использовали модифицированный раствор Кребса–Хензелайта следующего состава (мМ): NaCl – 158,3; KCl – 4; CaCl₂×2H₂O – 2; MgСl₂×2H₂O – 1,5; NaHCO₃ – 10; NaH₂PO₄×H₂O – 0,42; глюкоза – 5,6 (рН=7,4). Растворы оксигенировали карбогеном (О₂–95%, СО₂–5%), температура раствора поддерживалась на уровне +37±0,5°С с помощью ультратермостата U–8 (Болгария). Для регистрации сократительной активности кольца аорты подвешивались с одной стороны к неподвижному крючку ячейки, а с другой стороны – к датчику механотрона FT–03 (Grass Instrument Co., США), предназначенного для измерения изометрического напряжения. Перед экспериментом сегменты аорты предварительно растягивали нагрузкой 1 гр. (~9,8 мН) и промывали физиологическим раствором в течение ~45–60 минут для достижения равновесия [6; с.195–203].

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ OriginLab OriginPro v. 8.5 SR1 (EULA, Northampton, MA 01060–4401, США). Полученные результаты в экспериментах подвергали статистической обработке с использованием t–критерия Стьюдента. Данные представлены в виде М±m, где М – среднее, m – стандартная ошибка. Статистически значимыми считали различия при р<0,01 и р<0,05.

Результаты и обсуждение. Как показали предварительные исследования, 6–О–бензоилгетератизин в нормальных условиях в широком диапазоне концентраций (5–250 мкМ) не влияет на тонус препаратов аорты крысы. Эти данные свидетельствуют о том, что в состоянии покоя 6–О–бензоилгетератизин не вызывает активацию сократительного аппарата препарата аорты крысы. Однако в дальнейших экспериментах нами было обнаружено, что 6–О–бензоилгетератизин эффективно расслабляет препараты аорты крысы, предварительно сокращенные гиперкалиевыми растворами (КСl 50 мМ), т.е. обладает выраженным релаксантным действием. В частности, было обнаружено, что эффекты 6–О–бензоилгетератизина имеют дозозависимый характер и, начиная с концентрации 5 мкМ, он вызывал подавление силы сокращений на 6,5±2,4%, относительно контроля, степень которых возрастала с увеличением его концентрации и достигала максимума при 200 мкМ (до 73,8±4,6%, относительно контроля; n=4–6). В этих условиях значение ЕС₅₀ (концентрация вызывающая подавление силы сокращения на 50%) для 6–О–бензоилгетератизина состовляло 50,47 мкМ или pD₂(–logEC₅₀)=4,297 (рис. 2).

Известно, что КСl–индуцируемое сокращение ГМК аорты связано с активацией потенциал–зависимых Са²⁺_L–каналов (VOCC) плазматических мембран ГМК. При этом, увеличение [К⁺]_out изменяет потенциал мембраны и cледовательно вызывает деполяризацию, за счет этого активируется VOCC, что приводит к увеличению [Са²⁺]_in, которое в свою очередь вызывает сокращения ГМК [7; с.5047–5061; 8; c.158–229].

Рисунок 2. Влияние 6–О–бензоилгетератизина на механическое напряжение сегментов ГМК. Сила сокращения, индуцированная КСl (50 мМ), принята за 100%. (* – p<0,01; ** – p<0,05; n=4–6).

Учитывая это и анализируя полученные данные, можно предположить, что механизмы релаксантного эффекта алкалоида 6–О–бензоилгетератизина могут быть обусловлены подавлением поступления Са²⁺ в цитозоле ГМК, в результате блокирования VOCC сарколеммы. Для проверки этого предположения нами была выполнена специальная серия экспериментов, с использованием от разных концентрации ионов Са²⁺ в среде инкубации растворов Кребса–Хензелайта (рис. 3А). Результаты этих экспериментов показывают, что в реализации релаксантного действия 6–О–бензоилгетератизина важную роль играют [Са²⁺]_out, что может указывать на взаимодействие алкалоида с VOCC плазматических мембран ГМК. Вместе с тем в экспериментах было обнаружено, что релаксантное действие алкалоида 6–О–бензоилгетератизина заметно подавлялось нифедипином (0,01 мкМ) – специфицеским блокатором VOCC (рис. 3Б).

Рисунок 3. А. Зависимость вазорелаксантного действия алкалоида 6–О–бензоилгетератизина от [Са²⁺]_out в среде инкубации. Б. Влияние нифедипина на релаксантное действие алкалоида 6–О–бензоилгетератизина. Сила сокращения, индуцированная KCl (50 мМ), принято за 100% (* – p<0,01; ** – p<0,05; n=4–6)

Для дальнейшей характеристики механизма вазорелаксантного действия 6–О–бензоилгетератизина нами были изучены его эффекты на сокращения препаратов аорты, индуцируемые селективном агонистом α₁–адренорецепторов фенилэфрином (ФЭ), в развитии которых участвует ионы Са²⁺ поступающие в ГМК не только через VOCC, но и через рецептор–управляемые Са²⁺–каналы (ROCC), а также высвобождаемыми из саркоплазматического ретикулума (СПР) [7; с.158–229; 8; с.1438–1449].

При исследовании действия алкалоида 6–О–бензоилгетератизина на сократительные ответы, индуцированные ФЭ (1 мкМ), нами было обнаружено, что данный алкалоид и в этих условиях проявляют выраженное дозозависимое релаксантное действие. В предварительных экспериментах было показано, что 6–О–бензоилгетератизин (250 мкМ) на фоне контрактуры аорты, вызванной ФЭ (1 мкМ) вызывал подавление силы сокращений ГМК аорты крысы на 85,9±3,5%, относительно контроля (рис. 4).

Рисунок 4. Действие алкалоида 6–О–бензоилгетератизина на ФЭ (1 мкМ)–индуцированное сокращение препарата аорты крысы. Оригинальная запись сократительных ответов препараты аорты, стрелкой указан момент добавления ФЭ и 6–О–бензоилгетератизина (10–250 мкМ).

Известно, что сократительные ответы ГМК индуцируемые ФЭ обусловлены активацией рецепторов IP₃ Са²⁺–высвобождающих каналов СПР. В этих условиях и при блокировании VOCC верапамилом (0,1 мкМ) сократительные ответы индуцируемые ФЭ обеспечиваются поступлением ионов Са²⁺ по рецептор–управляемым (ROCC) и запас–оперируемым Са²⁺–каналам (SOCC) плазматической мембраны, которые функционально связаны с Са²⁺–транспортирующими системами СПР [7; с.158–229; 8; с.1438–1449; 9; c.1438–1449; 10; c.577–590; 11; c.201–206].

Учитывая это и анализируя полученные данные, можно предположить, что релаксантное действие алкалоида 6–О–бензоилгетератизина связано с его влиянием на ROCC и SOCC плазматической мембраны и Са²⁺– транспортирующими системами СПР ГМК.

В этих исследованиях нами было обнаружено, что 6–О–бензоилгетератизин условиях ФЭ (1 мкМ)–индуцированной контрактуры эффективно расслабляет препараты аорты крысы. При этом, релаксантный эффект 6–О–бензоилгетератизина также имел дозозависимый характер и при его концентрации 10 мкМ он вызвал расслабление препарата аорты на 14,8±4,3%, а максимальное расслабление до 85,9±3,5% наблюдалось при его концентрации 250 мкМ. В этих условиях значение ЕС₅₀ для 6–О–бензоилгетератизина состовляло 33,4 мкМ или pD₂(–logEC₅₀)=4,476 (рис. 5).

Результаты этих экспериментов свидетельствуют о том, что релаксантное действие 6–О–бензоилгетератизина, в условиях ФЭ (1 мкМ)–индуцированной контрактуры, в основном, обусловлено его влиянием на поступление ионов Са²⁺ в ГМК через ROCC/SOCC и на высвобождение из СПР.

Рисунок 5. Влияние 6–О–бензоилгетератизина на сокращения препаратов аорты крысы индуцируемые ФЭ (1 мкМ). Мышечное напряжение, индуцируемое ФЭ (1 мкМ), принято за 100% (* – p<0,01; ** – p<0,05; n=4–6)

Выводы. В целом, на основании полученных данных можно заключить, что релаксантное действие 6–О–бензоилгетератизина в основном реализуется благодаря его взаимодействием и с ROCC/SOCC плазматической мембраны ГМК (в условиях ФЭ (1 мкМ)–индуцированной контрактуры) и блокированию VOCC (в условиях KCl (50 мМ)–индуцированной контрактуры).

Данные, полученные в результате изучения механизмов действия алкалоида 6–О–бензоилгетератизина, имеют важное практическое значение и могут быть рекомендованы для оптимизации процесса целенаправленного создания нового поколения вазорелаксантных лекарственных средств. 

Список использованных сокращений:

1. ГМК – гладкомышечная клетка;

2. СПР – саркоплазматический ретикулум;

3. ФЭ – фенилэфрин;

4. [Cа²⁺]_in – внутриклеточная концентрация ионов кальция;

5. SOCC – запас–оперируемые Са²⁺–канал (store–operated Ca²⁺–channels);

6. ROCC – рецептор–управляемые Са²⁺–канал (receptor–operated Ca²⁺–channels);

7. VOCC – потенциал–зависимые Са²⁺–канал/Са²⁺_L–канал (voltage–operated Ca²⁺–channels).