Исследование поведения углеграфитового электрода, модифицированного пленкой висмута, в вольтамперометрическом определении витамина В2

Введение

Вольтамперометрические (ВА) методы анализа благодаря их высокой чувствительности, экспрессности, простоты использования аппаратуры находят все большее применение в определении большого ряда органических и биологически активных веществ. При этом большинство ВА-методов основано на применении в качестве сенсорного элемента капающего ртутного или ртутно-пленочного электрода, полученного на электропроводящей подложке методом ex- или in-situ [1-3]. Однако, из-за высокой токсичности материалов на основе ртути и возможными экологическими последствиями при утилизации ртутьсодержащих отходов, вопрос о создании экологически чистых электродов стал особенно остро.

Одним из путей решения этой проблемы является создание безртутных, экологически чистых электродов с каталитическим откликом путем модификации их поверхности или объема веществами, изменяющими протекание электрохимического процесса [4, 5].

Примером этого может быть модификация углеродсодержащих электродов висмутовой пленкой. Идея такой модификации возникла в начале 2000-х годов, когда особенно остро стал вопрос о запрещении Евросоюзом применения металлической ртути и ртуть-содержащих материалов в создании электрохимических датчиков и анализаторов на их основе [6, 7]. Выбор висмута в качестве модификатора обусловлен и тем, что его токсичность и токсичность висмут-содержащих солей незначительна по сравнению с ртутью и ее солями [7].

В ряде работ были показаны аналитически возможности вольтамперометрического определения тяжелых токсичных металлов с использованием углеродсодержащих электродов, модифицированных пленкой висмута [8-12]. Однако, оценка возможности применения Вi-модифицированных электродов в анализе органических соединений в научной литературе встречается очень редко [13-17]. В связи с этим нами проведено исследование поведения висмут-модифицированного электрода в определении витамина В₂ в некоторых фармацевтических препаратах.

Материалы и методы

Реактивы

В работе использовали буферные растворы Бриттона-Робинса, содержащие по 0,04 М уксусную, орто-фосфортную и борную кислоту в дистиллированной воде [18]. Необходимые значения рН буферного раствора регулировали добавлением в буферную смесь определенного объема 0,2 М NaOH.

Рабочие растворы рибофлавина (Reanal, Венгрия) готовили растворением коммерческого препарата в дистиллированной воде двойной перегонки.

Оборудование

В работе использовали компьютеризированный вольт-амперометрический комплекс на базе универсального полярографа ПУ-1 (ЗИП, Гомель, Беларусь) [19]. В качестве электрохимической ячейки служила стеклянная ячейка, объемом 20 мл из ЗИП-комплекта ПУ-1. Использовали трех-электродную систему, состоящую из рабочего измерительного углеродсодержащего электрода модифицированного пленкой Bi, изготовленного, как описано в [12], насыщенного хлоридсеребряного электрода сравнения и вспомогательного электрода из платиновой проволоки, диаметром ~ 0.2 мм.

Все значения рН были измерены с помощью универсального иономера И-130М с рН-селективным электродом ЭСЛ-63Г с точностью ± 0,01. Все потенциалы, указанные в тексте, проведены относительно нас. Ag / AgCl при комнатной температуре.

Анализ проб

Твердые образцы (таблетки), содержащие витамин В₂ растворяли в 10 мл дистиллированной воды и добавляли аликвоту объемом 100 мкл к 20 мл фонового электролита с рН = 2, находящегося в электрохимической ячейке. Жидкие образцы (растворы для инъекций) предварительно разбавляли дистиллированной водой двойной перегонки. Регистрировали вольтамперную кривую в оптимизированном для определения витамина В₂ режиме работы полярографа ПУ-1.

Концентрацию витамина В₂ оценивали по калибровочной кривой и по методу добавок. В качестве контрольного метода служил флуориметрический метод с использованием цифрового флуориметра КФМЦ-02 с соответствующими светофильтрами (λ_возб.= 450 нм и λ_изм.= 530 нм) [20, 21] . Все измерения проводились не менее трех раз.

Результаты и обсуждение

Витамин В₂ или рибофлавин (РФ - 7,8-диметил-10-рибитилизоаллоксазин - рис. 1) является водорастворимым витамином группы В [22]. Как и в случае других флавинов, изоаллоксазиновая кольцевая группа, присутствующая в химической структуре, отвечает за флуоресцентные и окислительно-восстановительные свойства.

Ранее также было показано, что окислительно-восстановительные процессы с флавином термодинамически обратимы, независимо от количества переданных электронов. Таким образом, все окислительно-восстановительные формы следует учитывать в электрохимическом механизме [23]. 

Рисунок 1. Строение молекулы рибофлавина

На рис.2. приведена вольтамперограмма на пастовом углеграфитовом электроде (1), модифицированного висмутом методом ex-situ, в фоновом электролите Бриттона-Робинса рН=2, скорость сканирования 100 мВ/с. На вольтамперограмме четко проявляется пик окисления висмута при потенциале выше - 0,05 В, при котором происходит растворение осажденного висмута, разрушающее пленку.

По этой причине последующие эксперименты были ограничены потенциалом -0,1 В. После приготовления Bi-модифицированный электрод помещали в электрохимическую ячейку, содержащую 0,1 ммоль/л витамина B₂ в фоновом электролите. Сканирование потенциала осуществляли в диапазоне - 0,8 ÷ - 0,1 В и обратно.

На циклической вольтамперограмме 0,1 мМ раствора рибофлавина в фоновом электролите Бриттона-Робинса рН 2 на Bi-модифицированном электроде наблюдается пара четко определенных пиков: катодный пик при -0,31 В, соответствующий восстановленной гидрохиноновой форме, и пик окисления при -0,23 В, соответствующий окисленной хиноновой форме рибофлавина. Эта интерпретация согласуется с опубликованными данными [3, 24, 25], и включает перенос двух протонов и двух электронов в электрохимическом процессе.

В то же время разделение анодного и катодного пиков, т.е.

ΔE_p = E_pa - E_pс = 80 мВ, указывает на медленную скорость реакции переноса электрона, хотя соотношение между анодным и катодным токами i_pa / i_pc составляет ~ 1,0. На вставке рис.2 показаны те же экспериментальные циклические вольтамперограммы, съемка которых осуществлялась на немодифицированном углеграфитовом электроде. Как видно из этой вольтамперограммы, никаких окислительных, или восстановительных пиков не наблюдается. Следовательно, можно сделать вывод, что пленка висмута проявляет себя как катализатор электрохимической реакции рибофлавина.

Исследование влияния скорости сканирования потенциалов на величину аналитического сигнала показало, что чувствительность Bi-модифицированного электрода при медленных скоростях развертки потенциала (10-50 мВ/сек) недостаточная для получения хорошего и воспроизводимого профиля вольтамперограммы.

Для скоростей сканирования более 50 мВ/с разделение между потенциалами анодного и катодного пиков увеличилось, что указывает на то, что поверхность висмут-модифицированного электрода не способствует быстрому переносу электронов, т.е. обратимая электрохимическая реакция для пары хинон / гидрохинон не наблюдается.

Исследование логарифмических зависимостей токов анодного и катодного пиков от скорости сканирования потенциалов показывает, что наклон прямых, выражаемый как tgα, близок к 1,0. Это позволяет сделать вывод, что перенос электронов на поверхности Bi-модифицированного электрода в присутствии рибофлавина подчиняется квазиреверсивной адсорбции, а, значит, окислительно-восстановительный процесс контролируется не диффузией, а межфазными явлениями [26].

Это заключение хорошо согласуется с тем фактом, что, как и в случае многих других твердотельных электродов, используемых для электрохимических исследований флавинов, трудно получить хорошо воспроизводимый отклик [27-29]. Это связано с тем, что витамин В₂ адсорбируется на поверхности электрода, модифицированного висмутовой пленкой, что отрицательно влияет на регистрируемые вольтамперограммы.

Очевидно, что продолжительность нахождения индикаторного электрода в аналите, обусловливает физическую адсорбцию рибофлавина на его поверхности. Поэтому был проведен эксперимент по оптимизации условий снятия вольтамперограммы в зависимости от начального потенциала и времени накопления.

На рисунке 3 показано влияние потенциала накопления и времени на анодный ток, связанный с окислением рибофлавина.

Было установлено, что воспроизводимые анодные пики регистрировались при потенциале накопления -1,0 В и времени между 90 и 120 секундами.

Эти результаты были взяты для последующих экспериментов.

Оптимизация параметров снятия вольтамперных кривых

Для рутинных количественных определений витамина В₂ нами был использован компьютеризированный вольтамперометрический комплекс на базе универсального полярографа ПУ-1 с программным управлением PowerGraph 2.0 (электронный самописец). Оптимизированные параметры настройки полярографа приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Параметры настройки полярографа ПУ-1

При указанных в таблице 1 параметрах настройки были сняты вольтамперные кривые для построения калибровочной кривой.

На рисунке 4 показаны вольтамперограммы, полученные при последовательном введении в модельный раствор с 0,5 мкмоль/л витамина В₂ стандартных добавок по 10 мкл 100 мкмоль/л и соответствующие им калибровочная кривая и стандартный график для последовательных добавок.

Как видно и тот, и другой график имеют линейный вид и практически идентичны, что подтверждает пригодность применения метода добавок в определении витамина В₂ в реальных образцах.

Для подтверждения практического применения разработанного метода, проводили сравнение соответствия полученных экспериментальных результатов с заявленным содержанием витамина В₂, приведенном в описании фармпрепарата.

Было исследовано три образца витамина В₂:

Образец А: Поливитаминный сироп для детей ПИКОВИТ®, ООО «КРКА ФАРМА», содержащий 1 мг В₂ в 5 мл.

Образец В: Рибофлавин-мононуклеотида раствор для инъекций 1% 1мл, Фармстандарт-Уфа Вита, Россия.

Образец С: Бентавит Валента фармацевтика ОАО (Россия) в таблетках по 100 мг витамина В₂.

Образцы витамина В₂ готовили в соответствии с процедурой, описанной в экспериментальном разделе, так, чтобы ожидаемая концентрация в анализируемом растворе была около 0,5 мкмоль/л (~0,2 мг/л). Контрольным методом служил флуоресцентный метод определения В₂.

В таблице 2 приведены результаты определения витамина В₂ в указанных образцах.

Таблица 2.

Результаты определения витамина В₂ в образцах фармацевтической продукции с использованием вольтамперометрического с Вi-модифицрованным электродом и флуориметрического методов

*- в квадратных скобках указаны критические значения параметров

Как видно, оба метода показали надежные результаты для аналитических параметров. Значения относительного стандартного отклонения S для среднего значения трех измерений составляли от 0,247 до 0,833 при количественном определении рибофлавина с использованием предлагаемого датчика и от 0,145 до 1,07 с использованием метода флуоресценции, демонстрируя хорошую точность этих методов.

Чтобы оценить достоверность результатов анализа, полученных двумя независимыми методами – вольтамперометрическим с Bi-модифицированным электродом и флуориметрическим, проведена их оценка по t-критерию Стьюдента и F-критерию Фишера [30]. Было показано, что при уровне достоверности 95% рассчитанные t и F- критерии значительно ниже их табличных критических значений, свидетельствуя тем самым высокую достоверность и статистическую идентичность методов.

Заключение

Проведенные исследования позволили прийти к следующим заключениям:

Модификация углеграфитового электрода пленкой висмута обеспечивает каталитический отклик индикаторной системы в присутствии рибофлавина.

Показано, что электрохимический процесс окисления-восстановления рибофлавина контролируется квазиобратимым переносом электронов, зависимым от рН среды, и включает одинаковое количество протонов и электронов. Оптимизированы условия вольтамперометрического определения микроколичеств рибофлавина на Bi-модифицрованном электроде. Проведено определение витамина В₂ в некоторых фармацевтических препаратах с применением метода стандартных добавок.

Полученные результаты были сравнены с результатами флуориметрического метода и оценены по t-критерию Стьюдента и F-критерию Фишера, показавшие высокую достоверность и статистическую идентичность применяемых методов.