Действие ороксилина A на проницаемость мембран митохондрий печени крыс

В настоящее время не вызывает сомнений важная роль в регуляции большинства физиологических и биохимических процессов, локализованных в митохондриях животных тканей белковых наноструктур, связанных с внутриклеточным метаболизмом, гомеостазом ионов, продукцией активных форм кислорода (ROS) и перекисным окислением липидов. [5, с. S413-S426; 6, с. 6306]. При некоторых патологических состояниях выявляются функциональные нарушения этих структур, участвующих в регуляции проницаемости мембран митохондрий и по результатам ряда исследований [9, с. 1072; 11, с. 727] их можно корригировать растительными соединениями. В связи с этим в настоящее время актуальным и рассматривают исследования, направленные на выяснение механизма действия таких соединений на организм на молекулярном, мембранном и клеточном уровнях с целью обнаружения потенциальных флавонов. Флавоны обладают весьма широким спектром действия на биологические объекты, демонстрируя антиоксидантные, цитопротекторные, гепатоза­щитные, антигипоксические, мембрано­тропные и т.п. эффекты [1, с. 38-43; 2, с. 41; 3, с. 228; 4, с. 660-663; 7, с. 398; 10, с. 179]. В проявлении некоторых физиологических эффектов флавонов на клетку известную роль может сыграть их способность влиять на проницаемость мембран митохондрий для различных ионов.

Цель настоящей работы - изучение действия флавона ороксилина А на пассивную проницаемость внутренних мембран митохондрий для одно-и двухвалентых.

Ороксилин А выделяли из растения Scutellaria guttata, его химическая структура представлена на рис.1. 

Рисунок 1. Структурная формула ороксилина А (5,7-дигидрокси-6-метоксифлавон)

Митохондрии из печени белых беспородных крыс выделяли методом дифференциального центрифугирования [13, с. 619-635]. Животное декапитировали, извлекали печень и помещали ее в стакан с ледяной средой выделения (СВ), содержащей 250 мМ сахарозы, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-хлорида, рН 7,4. После определения массы печень продавливали через механический пресс и гомогенизировали в тефлоновом гомогенизаторе в 6-кратном объеме СВ. Сначала центрифугировали при 450 g в течение 7 мин. при 0±2°С на центрифугы ЦЛР-1 с ротором углового типа, отделяли ядра и клеточные фрагменты. Потом супернатант центрифугировали при 4000 g в течение 15 мин. при 0±2°С. Осадок суспендировали в СВ без ЭДТА в соотношении 10:1. В течение эксперимента суспензия митохондрий хранились в ледяной бане. Содержание белка митохондрий определяли по методу Лоури в модификации Петерсона [12, с. 346-356].

Пассивную проницаемость внутренней мембраны митохондрий для различных ионов оценивали фотометрическим методом, регистрируя изменения оптической плотности суспензии митохондрий во времени при 540 нм. Кинетику проницаемости деэнергизованных митохондрий для ионов Н⁺, К⁺, Na⁺ и Са²⁺ измеряли в изоосмотических растворах нитратов соответствующих катионов [7, с. 398-411].

Полученные данные обрабатывались использо­ванием пакета программ Origin 6.1 (OriginLab Corporation, США). Величину Р<0,05 рассматривали в качестве критерия показатель достоверности различий.

При изучении действия ороксилина А на пассивную проницаемость мембран митохондрий для Н⁺ было показано дозозависимое увеличение скорости набухания деэнергизованных митохондрий (рис.2). Так, уже в концентрации 10 мкМ ороксилин А достоверно повышает скорость набухания митохондрий в 1.4, а при увеличений концентрации в 2 раза в 1.7 раза по сравнению с контролем. Достоверное увеличение скорости набухания митохондрий наблюдается и при действии ороксилина А в более высоких концентрациях 30, 40 и 50 мкМ, которые соответственно в 2.2, 2.5 и 3.2 раз больше, чем в контроле (рис.2).

Рисунок 2. Влияние ороксилина А на пассивную проницаемость мембран митохондрий для различных катионов.

Достоверными считали различия при * - Р<0,05. ** - Р<0,01. *** - Р<0,001.

Эксперименты по оценке протонной проводимости внутренней мембраны митохондрий проводили в изоосмотическом растворе нитрата аммония. Известно [8, с. 5404-5411], что митохондриальная мембрана относительно проницаема для ионов NO₃^– и NH₃⁺, но не для H⁺ и NH₄⁺. В ходе реакции - NH₃⁺ + H₂O ® NH₄⁺ + OH^– внутри митохондрий накапливаются ионы ОН^– и именно защелачивание матрикса митохондрий препятствует их набуханию в среде NH₄NO₃. Добавление в инкубационную среду в этих условиях вещества с протонофорной активностью приводит к переносу H⁺ через внутреннюю мембрану митохондрий, и, как следствие набуханию митохондрий.

Таким образом, на основании полученных данных можно заключить, что ороксилин А, дозозависимо увеличивающий проницаемость мембран митохондрий для ионов Н⁺, обладает протонофорной активностью.

Влияние ороксилина А на пассивную прони­цаемость мембран митохондрий для одновалентных катионов (Na⁺ и К⁺) изучали в изоосмотических растворах их азотнокислых солей. Известно, что внутренняя мембрана диэнергизованных Мх печени здоровых крыс более проницаема для катиона Na⁺, т.е. Na⁺→К⁺. Аналогичные данные получены нами (Рис 2, контроль), при этом изученные катионы располагались в ряд: Ca>H>Na>K, а численное соотношение (∆E 540/мин на мг белка) имело вид (величина ∆E 540 для Ca²⁺ принята за 1): 1,00 : 0,46 : 0,37 : 0,21.

Так, при внесении в среду инкубации с NaNO₃ 10 мкМ флавона скорость набухания митохондрий возрастает в 1,9 раза, а в присутствии 20, 30, 40 и 50 мкМ – в 2,3, 2,6, 3,2 и 3,4 раза, соответственно, в сравнении с контролем (рис.2). Аналогичные эксперименты с КNO₃ содержащей СИ показали, что эффект флавона на К⁺-проницаемость мембран намного менее, выражен чем его действие на проницаемость для ионов Н⁺. Таким образом, ороксилин А, наряду с протонофорной активностью также увеличивает и пассивную проницаемость мембран митохондрий для ионов К⁺ (рис.2). Также дозозависимым образом увеличивал скорость набухания митохондрий. В изоосмотической среде с Са(NO₃)₂, ороксилин А что свидетельствует о увеличении проницаемости мембран органелл для ионов Са²⁺ в присутствии исследуемого флавона (рис.2).

Суммируя приведенные выше данные, отметим, что 50 мкМ индуцированное ороксилина А изменение проницаемости внутренней мембраны митохондрий для изученных катионов можно представить следующим отношением (прони­цаемость для Са²⁺ принята за 1): Са²⁺ : H⁺ : Na⁺ : K⁺ = 1,00 : 0,92 : 0,76 : 0,30. Полученные данные свидетельствуют об увеличении в присутствии ороксилина А проницаемости мембран преимущест­венно для ионов Са²⁺ и в меньшей степени – для H⁺.

Таким образом, ороксилин А взаимодействует с мембраной митохондрий и увеличивает её пассивную проницаемость для катионов, преиму­щест­венно для Са²⁺ и Н⁺. Возможно, одна или несколько молекул флавона связывают опреде­ленный катион и переносят его по концентра­ционному градиенту в матриксе митохондрий, либо, встраиваясь в мембрану митохондрий, молекулы флавона образуют неспецифический ион-проводящий канал, о чем свидетельствует сохранения ряда прово­димости, полученного в контроле, в присутствии всех исследованных концентраций ороксилина А.

Ороксилин А дозозависимо увеличивает пассивную проницаемость мембран митохондрий для катионов Ca²⁺ и Н⁺ и в меньшей степени – Na⁺ и К⁺. Выявленная способность ороксилина А модулировать проницаемость мембран митохондрий может играть определенную роль в механизме действия изучаемого флавона на организм.