Микробиологические свойства третичных спиртов на основе дибензо-18-краун-6

Многообразие синтезированных к настоящему времени краун-эфиров приводит к необходимости проведения систематических исследований в терминах «структура – биологическая активность» среди структурно – подобных макроциклов, с целью изучения таких факторов, как размер макроцикла, природа заместителей, на микробиологическую активность. Результативный анализ позволяет прогнозировать биологические свойства краун-эфиров, осуществлять направленный синтез веществ с новыми свойствами, а также исследовать механизм биологического действия этих макроциклов.

Краун-эфиры и их производные обладают противомикробной и противопаразитарной активностью [1, с. 35]. Кроме того, с их помощью из организма выводятся токсичные тяжелые металлы, а также радиоактивные изотопы цезия и стронция.

Ранее [2, с. 200; 3, с. 147] были проведены исследования по действию около 100 производных бензокраун-эфиров на рост микроорганизмов, в том числе возбудителей бактериальных и грибковых заболеваний хлопчатника. Наиболее высокой активностью обладал ди-трет-бутил-дибензо-18-краун-6, который в концентрации 8-32 мкг/мл полностью подавлял развитие грибов. Близкая активность выявлена у дибутил-, дипропил- и диамилпроизводных дибензо-18-краун-6.

В тоже время нефтедобывающая промышленность несет огромные потери, связанные с микробной и электрохимической коррозией металлоконструкций. Биокоррозия приводит к огромному экономическому ущербу в промышленности, в основном, в нефтедобывающей и нефтеперерабатывающей.

Процесс биокоррозии сопровождается резким ухудшением эксплуатационных показателей нефтепромысловых трубопроводов, снижением их прочности, увеличением скорости образования микротрещин. Вопросы рационального использования нефтепромысловых трубопроводов в условиях рыночной экономики приобретают особо важное значение. Это объясняется тем, что нефтяная промышленность Узбекистана является одной из крупнейших отраслей тяжёлой индустрии. В связи с этим борьба с биокоррозией продолжает оставаться одной из самых важнейших проблем в системе мероприятий, направленных на повышение темпов добычи нефти. Поэтому биоповреждения металлических трубопроводов и конструкций в настоящее время выдвинуты в Узбекистане в новую самостоятельную отрасль науки.

По данным зарубежных исследований, от 50 до 70% коррозийного разрушения металлического оборудования и конструкций рассматривается как результат микробной деятельности. Биокоррозии металлических материалов и оборудования посвящена большая часть докладов конференций "Microbiology in Civil Engineering", проводящихся регулярно по инициативе вышеуказанного Комитета, а также Международной ассоциации микробиологов [4, с. 177].

Исследования по микробиологической коррозии проводятся в ряде нефтедобывающих стран [5, с. 65] (России, США, Украине, Азербайджане и др.). Однако специфичность состава и биология микроорганизмов-возбудителей биокоррозии нефтепромысловых трубопроводов в условиях жаркого, резко континентального климата Центральной Азии изучались в недостаточном объеме. Система эффективной антикоррозионной защиты трубопроводов, насосов, нефтехранилищ в специфических природных условиях нуждается в ингибиторах биокоррозии нового поколения.

В продолжение исследований полученных ранее третичных спиртов на основе дибензо-18-краун-6 [6, с. 41] были изучены ростстимулирующие, фунгитоксичные и ингибирующие свойства новых соединений.

1. Изучение ростстимулирующей активности третичных спиртов на основе дибензо-18-краун-6

Проведены исследования ростстимулирующей и фунгитоксичной активности следующих соединений краун-эфиров:

1. 4’,4”( 5”)-ди-(метилпропилоксиметил-)-дибензо-18-краун-6

2. 4’,4”( 5”)-ди-(метилбутилоксиметил-)-дибензо-18-краун-6

3. 4’,4”( 5”)-ди-(метилфенилоксиметил-)-дибензо-18-краун-6

4. 4’,4”( 5”)-ди-(метилаллилоксиметил-)-дибензо-18-краун-6

При определении ростстимулирующей активности использовали семена хлопчатника сорта С-6524, время инкубации 2, 4 и 7 дней, концентрации соединений 10,0, 5,0 и 2,5 мкг/мл.

Все испытанные соединения краун-эфиров не обладают заметной ростстимулирующей способностью, а напротив, проявляют ингибирующую активность на всхожесть и прорастание семян хлопчатника.

Рисунок 1. Контроль роста семян хлопчатника без добавления краун-соединений

Рисунок 2. Контроль роста (ингибирование) семян хлопчатника с добавлением краун-соединений

Третичные спирты на основе дибензо-18-краун-6 обладают ингибирующей активностью по отношению к всхожести и прорастанию семян хлопчатника;

2. Эксперименты по определению фунгитоксической активности препаратов проводили на двух возбудителях сельскохозяйственных растений –

Fusarium solani, который производит вомитоксин (ДОН), ниваленол (НИВ), зеараленон (ЗЭА), Т-2 токсин и вызывает фузариоз растений, при которой поражается корневая система, стебли, листья, колосья, зерно.

Alternaria alternate, который выделяет более десятка опасных токсинов, в том числе альтернариол, тенеазоновая кислота и др., поражающие все органы культурных растений, вызывая их гниение и порчу.

На основании проведенных экспериментов выявлено, что все образцы краун-эфиров обладают явной фунгитоксической активностью по отношению к изученным фитопатогенным грибам Fusarium solani и Alternaria alternate:

Рисунок 3. Контроль фунгицидной активности краун-соединений грибов Fusarium solani и Alternaria alternate 

Изменения в цвете микросклероций Alternaria alternata с черного на серый наблюдали при концентрации в 5 мкг/мл у краун эфиров 4’,4”( 5”)-ди-(метилфенилоксиметил-)-дибензо-18-краун-6 и 4’,4”( 5”)-ди-(метилаллилоксиметил-)-дибензо-18-краун-6. Кроме этого, вначале опыта цвет воздушного мицелия Alternaria alternata в течение долгого периода 4-5 суток оставался белого цвета, тогда как в контроле, уже через 2 суток цвет микросклероций становился черного, как и положено для этого гриба цвета. Следовательно, 4’,4”( 5”)-ди-(метилфенилоксиметил-)-дибензо-18-краун-6 и 4’,4”( 5”)-ди-(метилаллилоксиметил-)-дибензо-18-краун-6 оказывают влияние на развитие микросклероций Alternaria alternata, изменяя морфологию колоний.

По отношению к фитопатогену Fusarium solani 4’, 4”( 5”)-ди-(метилпропилоксиметил-)-дибензо-18-краун-6 проявил фунгистатическую активность в концентрации 5 мкг/мл. Процент ингибирования роста фитопатогена на 3-и сутки опыта составляет 20%.

Остальные концентрации 4-х краун эфиров – 2 и 10 мкг/мл не проявили антагонистической активности по отношению к изученным фитопатогенным грибам.

3. Ингибирующая активность третичных спиртов на основе ДБ18К6 к биокоррозии нефтяного оборудования:

На предприятиях НХК «Узбекнефтегаз», а именно нефтяных месторождениях Зафар, Шода, Тошкудук, Маржон наиболее активными участниками процессов биокоррозии нефтепромысловых трубопроводов в условиях жаркого резко-континентального климата Центральной Азии являются представители семейств бактерий:

Pseudomonaceae,     Rhodococcaceae,     Vibrionaceae,

Micrococcaceae         Desulfovibrioceae и др.

Микробиологический посев проводили на жидкую и твердую минеральную среду Раймонда следующего состава (г/мл): KNO₃-1.0; NaHPO₄- 0.8; KPO 0.14; МgSO₄- 0.1; NaCl- 1.0; вода дистиллированная - 1 часть; 1-1.5% стерильной нефти. Чашки Петри с посевом инокулировали в термостате при температуре 20-30 ⁰С, затем и в политермостате.

В исследованиях использованы питательные среды Раймонда с добавлением вышеуказанных синтезированных препаратов в концентрациях от 0.001 мг/на литр до 600 мг/на литр с интервалом 20 мг/на литр. Контролем служили эти же агаровые среды, но без добавления биоцидов (рис.4):

Рисунок 4. Контроль роста бактерий в среде без добавления биоцидов и с добавлением 4’,4”( 5”)-ди-(метилфенилоксиметил)-дибензо-18-краун-6

Разработанный нами метод позволил быстро определить минимальные концентрации каждого препарата, ингибирующие рост бактерий – возбудителей биокоррозии. Исследования показали эффективность и перспективность использования в качестве антимикробных ингибиторов биокоррозии 4’,4”( 5”)-ди-(метилфенилоксиметил)-дибензо-18-краун-6 из исследованных препаратов, которое в концентрации 0,01 мг на 1л элективной питательной среды, полностью уничтожали бактерии родов Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeroginoza, Desulfovibrio vulgaris, Desulfovibrio sp., Rhodococcus eruthropolis, Gallionella minor и др., вызывающих коррозию металлической поверхности нефтепромыслового оборудования и трубопроводов. Повышение концентрации до 0,4% не усиливает его биоцидного действия.

Таблица 1.

Влияние 4’,4’’(5’’)-ди-(метилалкилоксиметил-)-дибензо-18-краун-6 на рост микроорганизмов

*Примечание: 0_отсутствие подавления роста микроорганизмов, т.е. рост хороший;

**Примечание « - « подавление роста СВБ, т.к. не наблюдается образования черного осадка сульфида железа и отсутствует запах сероводорода;

+++_ сульфид железа не образуется, есть запах сероводорода.

Остальные органические соединения:

1. 4’,4”( 5”)-ди-(диметилоксиметил-)-дибензо-18-краун-6

2. 4’,4”( 5”)-ди-(метилэтилоксиметил-)-дибензо-18-краун-6

3. 4’,4”( 5”)-ди-(метилпропилоксиметил-)-дибензо-18-краун-6

4. 4’,4”( 5”)-ди-(метилбутилоксиметил-)-дибензо-18-краун-6

5. 4’,4”( 5”)-ди-(метилпентилоксиметил-)-дибензо-18-краун-6

6. 4’,4”( 5”)-ди-(метилаллилоксиметил-)-дибензо-18-краун-6

не оказывали значительного бактеристатического или бактерицидного влияния на микроорганизмы.

Экспериментальная часть

Питательная среда для выделения микроорганизмов - возбудителей биокоррозии. Для развития железобактерий использован ряд сред. Из которых самая оптимальная - это среда Тайлера.

Среда Тайлера: дрожжевой экстракт 0.05 г, MnSО₄·4H₂O 0.02 г, Дистиллированная вода 1000 мл

Для получения твердой среды добавляют 2.0 %-ный агар –агара Дифко.

Железо добавляют в виде сернистого железа, которое разбалтывают в расплавленном 1.5% - ном растворе агар-агара и вносят на дно пробирки. После того, как агар застынет, стерильную жидкую среду наливают высоким слоем (5 – 7см) поверх агар –агара и через нее пропускают ток углекислоты. Активную реакцию среды доводят до pH= 6-7.

Осадок сернистого железа получают путем осаждения сернокислого железа сульфидом натрия в эквимолярных растворах. Пробирки поверх ватной пробки затыкают корковой пробкой.

Среда Раймонда (г/л): Na₂C0₃ -0.1; MgS0₄·7H₂0 – 0.2; FeS0₄·7H₂0 – 0.02; СаС1₂ – 0.01; MnS0₄·5H₂0 – 0.02; К₂НР0₄Х 3H₂0 – 1.0; NaH₂P0₄·2H₂0 – 1.5; NH₄NO₃-2.0; агар – 12.0 [25-29].

Культивирование проводили на круговых качалках при 160 об/мин. Единственным источником углерода и энергии служило стерильное дизельное топливо.