Стимулирующий эффект препарата эмистима С при прорастании гороха (Pisum sativum L.) на разных фазах клеточного цикла

Введение:

Гормональная система растений влияет на все аспекты роста и развития растений. Понимание, как работает эта система, дает возможность побороть многие неблагоприятные факторы, которые ограничивают естественные циклы роста растений и генетическую экспрессию. Растительные гормоны присутствуют на разных стадиях жизненного цикла растений. Они могут быть доступны в достаточном количестве в течение всего жизненного цикла растения для максимизации генетической экспрессии. Растительные гормоны должны постоянно производиться и регулироваться клетками кончиков корней в достаточном количестве, чтобы поддерживать жизненные процессы и оптимизацию гормонального баланса.

Гормональные уровни растения изменяются в зависимости от биотических или абиотических факторов внешней среды в двух направлениях:

Во-первых, сигнальная система растения, которая находится в верхней части корневой системы, контролирует изменения во внешней среде, регулирует изменения уровня гормонов во всех тканях растения;

Во-вторых, энзимы, производящие гормоны, имеют определенную температуру работы. Гормоны не могут эффективно производиться при очень высокой или очень низкой температурах (Рис.1).

Гормональный дисбаланс может вызвать любая стрессовая ситуация:

Абиотический стресс: жесткие погодные условия, высокий уровень азота, соленость, токсичность и уплотненность почв, и т.д.

Биотический стресс: заболевания, вредители, сорняки, гербициды, загрязненность почв тяжелыми металлами и т.д.

Превышающие факторы среды (избыток)

-----------------------------------------------------------------------------------------------

Температура вода свет ветер нитраты питание

(NO₃)

t ≥ 32⁰ C ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑

 ----------------------------------------------------------------------------------------------

ОПТИМАЛЬНАЯ ЗОНА РОСТА (20⁰- 32⁰ C)

-----------------------------------------------------------------------------------------------

t ≤ 20⁰ C ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ (NO₃) ↓

температура вода свет ветер нитраты питание

-----------------------------------------------------------------------------------------------

Понижающие факторы среды (недостаток)

Рисунок 1. Диапазон температур, при которых оптимально производятся фитогормоны

При стрессе обычно происходит следующее: разрушаются или изменяют свою пропускную способность мембраны; происходит увеличение повреждений окисляющих агентов; снижение необходимой нормы функции протеинов. На уровень растительных гормонов влияют также питательные вещества, как катализаторы гормонального синтеза, так и восприятия. Способность корней поглощать питательные вещества из почвы зависит от рН почвы и наличия хелатирующих агентов. Антиоксиданты снижают уровень радикалов кислорода для защиты клеточных мембран, энзимов, ДНК, снижая повреждения клеток и стресс. Комплекс полиаминов стабилизирует клеточную структуру, увеличивает доступность и эффективность питательных веществ. N-HIB –технологии увеличивают количество энергосберегающего нитрата амина (NH₂). Эта технология [14, 15] позволяет преобразовывать мочевину в аминную форму азота, ингибируя активность энзимов «уреаза». Растение минует фазу преобразования нитратной формы азота в аминную, что позволяет растению сохранять сахар в плодах. Эта техника способствует поднятию на 50% нижнего уровня использования мочевины из-за сокращения потерь азота при вымывании и испарении; конт­ролировать вегетативный рост при дополнительном использовании энзимами «редуктазы нитратов» с преобразованием неиспользуемого NH₃ в используемый аминный азот NH₂ . Увеличить доступность сахара в растении для роста плодов, сухого вещества, специальной тяжести, показаний Брикс. Эти процессы происходят из-за увеличения энергии фотосинтеза, доступной для производства сахара и синтеза аминокислот, что увеличивает его поток из листьев в плоды.

Учитывая эти факторы и предварительные имеющиеся данные по изучению механизма действия биологически активных веществ – регуляторов роста растений, мы на примере препарата эмистима С, изучили его действие в широком спектре концентраций разведений на разных фазах клеточного цикла на примере корешков проростков гороха.

Цель исследования:

Раннее было показано [11], что динамика изме­нения структурного и функционального состояний генома имеет сортовую и видовую специфику, чем может быть обусловлена необходимость разной продолжительности обработки семян для получения стимулирующего эффекта. Авторы считают [1, 2, 3, 13, 14], что важная роль в модели клеточного цикла принадлежит тому, чтобы выяснить механизм действия фитогормональных соединений и физиологически активных рострегулирующих веществ, которые являются мощным фактором увеличения продук­тивности сельскохозяйственных культур. В нашей работе на примере корешков проростков гороха (сорт Рапорт) показана активность действия эмистима С на разных фазах прорастания. Известно временное распределение фаз клеточного цикла [10-12, 13, 15] по схеме, которая позволяет откалибровать проросшие семена по фазам клеточного цикла:

 Сухое семя → G₀ → G₁ → S → G₂ → Митоз

 0 ч. 3-6ч. 16-19ч. 28-31ч. 33-36 ч. 38-41ч.

Методика проведения опытов:

Клетки прорастающих семян гороха высоко­чувствительны в период активации хроматина и максимально восприимчивы к влиянию физиологически активных веществ (Троян В.М., 1998) [7, 9]. Клетки зародышей были использованы нами для подбора эффективных концентраций ФАВ – в частности к эмистиму С. В работе соблюдали следующие экспериментальные условия:

1. Семена замачивали в постоянном объеме воды до половины высоты семени при постоянной температуре 24⁰ С.

2. Для равномерного прорастания отбиралась фракция однородно набухших семян через три-четыре часа после инкубации в воде.

3. Для отбора клеток в период выхода из сос­тояния покоя использовались полностью набухшие семена без признака роста зародыша.

4. Для отбора клеток в G₀–фазе использовались семена с признаками видимого роста зародыша, но до проклевывания, а для отбора клеток, вступающих в G₁–фазу – семена в момент проклевывания.

5. Для получения максимального количества клеток в S–фазе длина проклюнувшегося корешка должна быть в пределах 0,5 – 0,8 см, а в митозе –
1,2 – 1,5 см.

Выполняя данные условия, можно получить определенное количество клеток с уровнем синхронности не ниже уровня живых систем клеток на протяжении пререпликативного периода и в S–фазе цикла, что позволяет смоделировать схему проверки активности действия эмистима С в период фаз клеточного цикла.

В эксперименте проводили обработку в течение трех часов в растворах эмистима С в концентрациях растворов от 10^-4 до 10^{-9 М на тех этапах прорастания гороха, которые соответствовали определенным фазам цикла в меристеме.}

Для G₀–фазы семена, предварительно замо­ченные в воде на три часа, обработали в течение трех часов последовательными концентрациями (от

10^-4 до 10^-9М) эмистима С, промывали водой и инкубировали в термостате 5-6 дней при температуре 24⁰ С.

Для G₁–фазы семена гороха замачивали на 16-19 часов, затем 3 часа обрабатывали эмистимом С, промывали водой и выращивали на влажных фильтрах в течение 5-6 дней при температуре 24⁰ С.

Для S–фазы замачивали семена на 28 часов с последующей обработкой семян эмистимом С в течение трех часов, промывали водой и оставляли на влажных фильтрах на 5-6 дней при той же температуре.

Так же поступали с семенами при митозах, но замачивали их на 38-41 час.

Учет опытных образцов гороха проводили, срав­нивая с контрольными по общей массе корешков, гипокотилей и средней массе одного корешка и одного гипокотиля. Стимуляцию вычисляли в процентах.

Нами были исследованы тип и спектр физиологической активности препарата эмистима С, которая отображалась на графиках, как неравномерная кривая спадов и подъемов активности в зависимости от разведений препарата эмистима С на проростки гороха посевного Pisum sativum L. на разных стадиях прорастания. Имея 2-3 и более подъемов активности на графиках, можно говорить о наличии доза-эффект [2, 3]: стимуляции препаратом в нескольких концентрациях. Нами были использованы методики подсчетов биотестов и митотических индексов [4, 5, 8].

Результаты исследований и обсуждение:

Готовили препараты, фиксированные и окрашенные по общепринятой методике Паушевой для подсчета митотических индексов [8]. На графическом рисунке (Рис.2) и таблицах 2, 4, отображены 5 средних вариантов времени забора корешков для цитофизиологического исследования. По наибольшему среднему митотическому индексу – это на 36 час фиксации, судили о наиболее удобном времени обработки семян гороха стимулятором роста эмистимом С.

Таблицы: 1, 3. Одновременно отбирали такие же варианты корней проростков гороха, необрабо­танные стимулятором (вода) в качестве контроля. Это также 5 вариантов: 36 часов, 39 часов, 42 часа, 45 часов и 48 часов. Препараты, окрашенные ацетоорсеином, просматривали в 100 полях зрения в микроскопе при увеличении10х90 для каждого корня в 4-5 биологических повторностях. Вели подсчет, как общего числа клеток в каждом поле зрения, так и числа делящихся клеток по фазам митотического цикла. Анализируя данные контроля, мы имеем распределение митотических индексов по времени: 1 вариант 6,23%, 2 вариант 4,09%, 3 вариант 1,79%, 4 вариант 2,78%, 5 вариант 4,20%. (График не публикуется).

В опыте (обработка эмистимом С в концен­трации 10^{-9 М): 1 вариант 7,73%, 2 вариант 6,93%, 3 вариант} 4,33%, 4 вариант 3,82%, 5 вариант 3,58%. В опыте митотический индекс выше, в профазах средние значения на порядок выше, чем в контроле. Смотри Рис. 2 «Митозы» и Рис.3 «Стимуляция по правилу доза-эффект».

По результатам приведенных данных можно сделать вывод, что почасовая фиксация показала тенденцию уменьшения величин митотических индексов от длительности времени прорастания. Через больший промежуток времени уменьшалось количество клеток, находящихся в митозе [1-3, 6, 13].

Согласно данным, приведенным в статье Цыганковой В.А. и авторов [12], «Молекулярно-генетический контроль ауксиновых сигналов: передача и реализация», генная экспрессия согласуется с молекулярно генетическим контролем ауксиновых сигналов. А эмистим С как раз и является биологическим комплексом, состоящим из гормонов ауксинового, гибберелино-цитокининового ряда, 15 типов аминокислот, олигосахаридов, жирных кислот, микроэлементов и витаминов. Он стимулирует рост и развитие практически всех сельскохозяйственных и декоративных культур. Он получен путем микробиологического синтеза на основе продуктов жизнедеятельности грибов везикулярно-арбус­кулярной микоризы из растений жень-шеня и облепихи. Препарат запатентован в Институте биоорганической химии и нефтехимии (г. Киев) и нашел свое широкое применение во многих зарубежных и странах СНГ [7, 9].

В обзоре [12] предоставлены данные относительно регуляторных компонентов путей сигналов индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) в растительной клетке (мембранные белки-рецепторы, чувствительные к экзогенным сигналам ИУК, система вторичных мессенджеров (цАМФ, цГМФ, инозитолтрифосфат и диацилглицерол, цитоплаз­матический кальций, «сенсорный» белок кальциевых сигналов – кальмодулин), которые опосредуют передачу сигналов ИУК от рецепторов на эффекторы (ферменты), катализирующие внутриклеточный метаболизм). Приведен список недавно идентифицированных генов, детерминирующих синтез белков-участников передачи сигналов ИУК у арабидопсиса: ген АВР1, кодирующий мембранный белок – рецептор ИУК; AtCP1 и AtCBL1 гены, кодирующие «сенсорные» белки кальция; многочисленные семейства MDR генов мембранных белков, которые включены в активный АТФ-зависимый транспорт протонов от ИУК через клеточные мембраны, PIN гены белков, контролирующих пассивный полярный интра - и интерклеточный транспорт анионов от ИУК; ARG1 и RCN1 гены белков, ответственных за передачу гравитропических сигналов и регулирующих транспорт анионных форм ИУК через мембраны специализированных гравичувствительных клеток – статоцитов; VTI гены SNARE белков-транспортеров, участвующих в везикулярном интраклеточном транспорте ИУК и AtMRP5 гены белков-транспортеров конъюгированных форм ИУК; ARF гены ауксин-активируемых трансфакторов, контро­лирующих экспрессию ранних/первичных ауксин-регулируемых Aux/IAA, SAUR, GH3 ACS генов, а также многочисленных семейств SKP1, RBX1, ATCUL1, ASK1, ASK2, AXR1, ECR1, RCE1, ENR2p, Cdc53p, Scp1p, TIR1 генов белков (составных убиквитин-белок лигазного комплекса) и CSN генов белков (составных мульти-субъединичного белкового регуляторного комплекса COP9 сигналосом) – компонентов убиквитин/протеосом-опосредованного пути распада Aux/IAA белков, репрессирующих передачу ауксиновых сигналов.

Рассмотрена гипотетическая модель регуляции экспрессии генов ИУК.

 Таблица 1.

Зависимость митотических индексов от времени в кончиках проростков корешков гороха

Контроль

Из расчета на каждые 100 полей зрения

Таблица 2.

Зависимость митотических индексов от времени в корешках проростков гороха под действием эмистима С

Из расчета на каждые 100 полей зрения

Таблица 3.

Зависимость митотических индексов от времени в кончиках корешков проростков гороха

Контроль

1,2,3,4 – % делящихся клеток по фазам цикла от числа делящихся клеток

5,6,7,8 – % делящихся клеток по фазам цикла от общего числа клеток в поле зрения

Таблица 4.

Зависимость митотических индексов от времени под действием эмистима С в кончиках корешков проростков гороха

1,2,3,4 – % клеток в каждой фазе митоза от числа делящихся клеток

5,6,7,8 – % клеток в каждой фазе митоза от общего числа клеток

Рисунок 2. Влияние эмистима С на величину митотических индексов в меристеме гороха посевного на разных фазах клеточного цикла

Заключение

Сравнивая активность эмистима С на трех фазах клеточного цикла (по МИ в G₀, G₁, S) кончиков корешков проростков гороха посевного сорт Рапорт, можно сделать вывод, что наибольшей активации можно достичь, обрабатывая семена на стадии G₀. (Рис. 3), где митотические индексы были на порядок выше по сравнению с контролем: 7,7 (на 36 час), 6,9 (на 39 час), 4,3 (на 42 час) и 3,8 (на 45 час), 3,6 (на 48 час), Рис. 2.

Из данных, проведенных в результате проведенных экспериментов следует, что клетки прорастающего семени гороха в период повышенной активности генома максимально чувствительны к действию физиологически активных веществ – эмистима С. На всех фазах клеточного цикла наблюдается чувствительность к действию физиологически активных веществ, находящихся в составе эмистима С. Причем действие это подчиняется правилу Арндта-Шульца (Arndt-Schultz), и выражается в периодических спадах и подъемах пиков активности (от 1 до 3 и более). Согласно этому правилу кривая доза-эффект имеет один максимум, но Попов, Иванова [4, 10] установили, что кривая имеет два и более максимумов, в ее ходе наблюдаются повторяемость форм в начальном, среднем и конечном интервалах, что дает возможность построить обобщенный график волнообразной кривой доза-эффект, где средний интервал соответствует максимуму кривой Арндта-Шульца и характеризуется несколькими (чаще всего двумя) максимумами и одним минимумом. Его обозначают как интервал насыщения. Конечный интервал характеризуется преобладанием торможения. Эти авторы указывают на то, что стимулирующий эффект не бывает стабильной, неизменной величиной, а зависит от реакции организма (главная волна) и от условий среды (второстепенные волны) [4, 7, 9, 10].