Количественное определение сесквитерпеновых лактонов британина и инучиненолида с в цветках девясила британского Inula britannica L. методом ВЭЖХ

Девясил – род растений семейства Астровые (Asteraceae) порядка Астроцветные (Asterales), имеет около двадцати видов, девять из которых произрастают в Узбекистане. Девясил британский Inula britannica L. – многолетнее растение высотой около 65 см, произрастающее во всех районах Средней Азии, кроме пустынных мест (Каракумы, Кызылкумы) на сырых лугах и среди кустарниковых зарослей на берегах рек, саев и озер, по опушкам и понижениям островных лесов от предгорий до среднего пояса гор [1, с. 456-457].

Девясил британский широко используется в народной медицине: отвар применяют как антигельминтное, тонизирующее, общеукрепляющее, стимулирующее обмен веществ, при алкоголизме, желтухе, заболеваниях печени, желудка и т.д. [2, с. 129-130].

С точки зрения традиционной медицины интерес представляют содержащиеся в нем сесквитерпеновые лактоны. Обладая широким спектром биологической активности, они находят применение в фармакологии в качестве антигельминтных, противоязвенных и противоопухолевых препаратов.

Ранние фитохимические исследования листьев и соцветий девясила британского показали наличие сесквитерпеновых лактонов британина [3, с. 251-252; 4, с. 165], 3β-гидроксиэупатолида, изотелекина и его производных, 15-дезокси-цис,цис-артемизиифолина, 3β-гидрокси-2α-сенециоилокси-изоаланто-лактона [5, с. 1244-1245], гайллардина [6, с. 1277-1279] и пульхеллина С [7, с. 879-880].

Интенсивное накопление сесквитерпенового лактона британина в тканях является видовой особенностью некоторых растений рода Inula L.

Известно, что сесквитерпеновый лактон британин обладает противоопухолевой активностью и ингибирует рост лимфосаркомы Плисса на 54-60% [8, с. 28].

Недавними исследованиями показано, что британин проявляет противовоспалительную и противоастматическую активности [9, с. 296], может выступать потенциальным препаратом при лечении аллергически-воспалительных болезней [10, с. 935; 11, с. 193], а также улучшает состояние при церебральном ишемическо–реперфузивном повреждении, включая Nrf2-защитный путь [12, с. 3].

Британин и эригеролид являются структурными изомерами, отличающимися местоположением ацетильной группы: у британина она находится при С6, а у эригеролида – при С4.

В работе [13, с. 233-236] авторами высказана идентичность сесквитерпенового лактона инучиненолида С и эригеролида.

В связи с тем, что британин и инучиненолид С являются близкими по структуре соединениями, нами были проведены исследования по количест­венному определению сесквитерпеновых лактонов британина и инучиненолида С в цветках девясила британского, что является актуальным для поиска новых источников и стандартизации растительного сырья.

В последние десятилетия, благодаря совершенст­вованию техники, метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) стал одним из наиболее распространенных в области химии природных соединений и активно применяется для анализа сесквитерпеновых лактонов [14, с. 382-407].

К преимуществам ВЭЖХ (и особенно ее наиболее часто применяющегося обращено-фазного варианта – ОФ-ВЭЖХ), можно отнести высокую чувствительность, точность и воспроизводимость анализов. В отличие от своей нормально-фазовой разновидности, в которой взаимодействие веществ с высокополярным сорбентом при длительном разделении может приводить к нежелательным изменениям в их структуре или газовой хроматографии, во время проведения которой возможна термодеструкция веществ, ОФ-ВЭЖХ является достаточно быстрым и недеструктивным методом с высокой разрешающей способностью. Это имеет немаловажное значение в анализе сескви­терпеновых лактонов, предполагающем наличие лабильных и в определенном виде растения структурно близких соединений.

Целью данной работы является выделение биоло­гически активных сесквитерпеноидных лактонов британина и инучиненолида С из цветков Inula britannica L., разработка метода ВЭЖХ и их анализ в хлороформной и этилацетатной фракциях спиртового экстракта с целью количественного определения в исходном растительном сырье.

Материал и методы

Идентичность сесквитерпеновых лактонов опре­де­ляли сопоставлением температур плавления и ИК спектров выделенных соединений с непосредственными образцами лактонов. ИК-спектр снимали на Фурье-спектрометре фирмы Perkin-Elmer модель 2000 (KBr). Качественную идентификацию веществ на хроматограммах в процессе ВЭЖХ анализа проводили сопоставлением времен удерживания стандартных образцов и содержащих их проб в аналогичных условиях.

Видовая принадлежность определена сопостав­лением собранных гербарных образцов с гербарным материалом Inula britannica L., хранящихся в Центральном гербарии Узбекистана (объединенные гербарии Ташкентского Государственного Университета и Института ботаники АН РУз).

Британин. Бесцветные кристаллы с т.пл. 193-194 °С. ИК спектр (ν, см^-1): 3529 (ОН), 3018, 2982, 2952, 2875, 1763 (С=О g-лактона), 1726 (С=О сложного эфира), 1713 (С=О сложного эфира), 1664, 1461 (С=С), 1433, 1409, 1376, 1314, 1255 (С=С), 1161, 1098 (С-О-С), 1055 (С-О-С), 1026, 999, 980, 944, 865, 812, 682, 652, 631, 611, 548, 474.

Инучиненолид С. Порошок с кремовым оттенком с т.пл. 151-153 °С. ИК-спектр (ν, см^-1): 3443 (ОН), 3099, 2973, 2944, 1764 (С=О g-лактона), 1729 (С=О сложного эфира), 1714 (С=О сложного эфира), 1662, 1466 (С=С), 1380, 1363, 1256 (С=С), 1161, 1115 (С-О-С), 1088 (С-О-С), 1063, 1037, 1023, 1009, 982, 942, 854, 825, 718, 647, 593, 539, 497, 466, 434.

Получение хлороформной и этилацетатной фракцийэтанольного экстракта цветков девясила британского. 250 г сухих и измельченных цветков, собранных в июне в Ташкентской области Республики Узбекистан, заливали 95%-ным этанолом до «зеркала». Экстракцию проводили пять раз по 8 часов. Объединенные экстракты сгущали на роторном испарителе до малого объёма. Смешивали густой экстракт с силикагелем КСК в соотношении 1:1 (вес:вес) и помещали на хроматографическую колонку с силикагелем КСК. Соотношение сили­кагель: сумма составляли 2:1 (вес-вес). Сначала из колонки вымывали экстракционным бензином липидоподобные соединения и эфирные масла, затем элюирование проводили последовательно хлороформом и этилацетатом. Полноту выделения фракций определяли визуально и при помощи ТСХ. Фракции сгущали и высушивали. В результате получено хлороформной фракции 3.17 г, этилацетатной фракции – 6,6 г.

ВЭЖХ анализ проводили на хроматографе Agilent 1100 (Agilent Technologies Inc., США), оснащенном 4-х градиентным насосом G1311A, дегазатором G1322A серии 1260, градиентным смесителем, детектором с переменной длиной волны (VWD) G1314A и ручным петлевым инжектором Rheodyne 7725i (Rheodyne, США) на колонке Supelco Discovery HS C18 (4.6x75 мм/3 мкм), укомплектованной предколонкой Zorbax Eclipse XDB C8 (4.6x12,5 мм/5 мкм) в следующих условиях: изократический режим, состав мобильной фазы: - 35% ацетонитрил (Chromasolv R, Sigma, Германия, содержание ацетонитрила по ГХ не менее 99,8%, пропускание при 220 нм не менее 90%) в 0,05 % водном растворе ортофосфорной кислоты рН 2,5, скорость потока 0,7 мл/мин, детектирование – спектрофотометрически при 220 нм. Объем образца 10 мкл.

Приготовление рабочих стандартных образцов (РСО) и растворов проб. Стандарты. Навески по 20 мг РСО сесквитерпеновых лактонов британина и инучиненолида С, выделенных по известным методикам [3, с. 251-252, 15, с. 757-758], количественно отвесили на аналитических весах, поместили в мерную колбу объемом 10 мл и растворили в метаноле для ЖХ (исходный стандартный раствор). Дальнейшим разведением этой смеси получили производные растворы, с концентрациями лактонов 0,25, 0,5 и 1 мг/мл, каждый из которых вместе с исходным раствором трижды анализировали методом ВЭЖХ. Полученные результаты усредняли и использовали для получения калибровочных прямых (рис. 3 а-б ). Калибровочная кривая имела в указанном интервале концентраций линейный вид (коэффициенты корреляции между концентрациями и площадями пиков обоих веществ составляли не менее 0,999). Коэффициенты корреляции получали в программном пакете ChemStation for LC (ревизия A.09.03(1417) 2002 © Agilent Technologies, США)

Образцы. Навеску 20-50 мг сухого остатка, оставшегося после упаривания жидкой хлор­оформной или этилацетатной фракции до постоянной массы, взвешенную на аналитических весах, растворяли в метаноле для ЖХ при легком нагревании на водяной бане в таком объеме, чтобы конечная концентрация вещества была 10 мг/мл (т.е., например, 20 мг разбавляли в 2 мл, 50 мг в 5 мл и т.д.) и анализировали методом ВЭЖХ в условиях, аналогичных анализу стандартных растворов. Концентрации лактонов рассчитывали по ранее полученным калибровочным прямым.

Результаты и их обсуждение

Сесквитерпеновые лактоны, будучи по большей части соединениями со средней полярностью, хорошо экстрагируются из растительного сырья этанолом. Выбранный для дальнейшего фракцио­нирования растительного экстракта метод колоночной хроматографии на силикагеле позволяет разделить биологически активные соединения по полярности более тонко, получив обогащенные ими суммы. В данном случае фракционирование производили последовательно хлороформом и этилацетатом, предварительно удалив липофильные соединения бензином.

В процессе разработки количественного метода ВЭЖХ использовали 3 колонки от разных производителей, характеризующиеся одинаковым поперечным сечением, но различными длинами, зернением и природой упакованного в них сорбента: Supelco Ascentis C18 (4,6x250/5 мкм), Zorbax Eclipse XDB C8 (4,6x150/5 мкм) и Supelco Discovery HS C18 (4,6x75 мм/3 мкм). Исходя из многочисленных экспериментальных данных, фазы на основе октил- (С8) и октадецил (С18)-силикагелей не имеют различий по селективности разделения, фазы на основе С18 характеризуются лишь немного более сильным удерживанием. Эффективность разделения, как и ожидалось, была наилучшей у колонки с самым большим числом теоретических тарелок - Supelco Ascentis C18 (около 30 тыс. теоретических тарелок (ТТ)), упакованной фазой на основе С18-силикагеля; Zorbax Eclipse XDB C8 на основе октилсиликагеля (ок. 14,5 тыс. ТТ), занимала промежуточное положение. За счет вдвое меньшей длины, но более мелкого зернения сорбента (3 против 5 мкм) ей лишь незначительно уступала колонка Supelco Discovery HS C18 (ок. 11,5 тыс. ТТ, фаза С18). Однако из-за меньшей длины, время анализа, а значит и расход растворителей при ее использовании были значи­тельно меньшими, чем на первых двух колонках. Принимая во внимания эти обстоятельства, а также тот факт, что эффективность разделения изучаемых соединений на Supelco Discovery HS C18 достаточна, мы использовали ее в качестве основы количественного метода. Время удерживания в приведенных условиях составляет для британина 5,8 мин, а для инучиненолида С – 7,1 мин. Объем вводимого образца – 10 мкл. Время анализа – до 10 мин.

Для получения калибровочных данных 4 раствора с концентрациями лактонов в пределах 0,25-2,0 мг/мл анализировали методом ВЭЖХ в описанных выше условиях (Рис. 1). Последующий анализ фракций спиртового экстракта проводили в тех же условиях, что и анализ стандартов. Расчет содержания сесквитерпеновых лактонов во фракциях спиртового экстракта вели по предварительно пост­роенной калибровочной линии, полученной анализом известных концентраций веществ. Калибровочная таблица и прямые представлены на рисунках 2-4.

Рисунок 1. Хроматограммы РСО растворов 0,5, 1 и 2 мг/мл британина и инучиненолида С, слева направо соответственно

Рисунок 2. Калибровочная таблица (скриншот)

Рисунок 3. Калибровочные прямые по британину (а) и инучиненолиду С (б) при 220 нм

Как видно из рис. 3, коэффициенты корреляции между концентрациями исследуемых соединений и соответствующими им площадями пиков составляли не менее 0,999, что свидетельствует о высокой линейности полученной калибровочной линии.

На рис. 5 и 6 представлены хроматограммы анализируемых фракций.

Рисунок 5. ВЭЖХ хроматограмма хлороформной фракции этанольного экстракта цветков девясила британского

Рисунок 6. ВЭЖХ хроматограмма этилацетатной фракции этанольного экстракта цветков девясила британского

Результаты количественного анализа британина и инучиненолида С во фракциях этанольного экстракта девясила британского Inula britannica L., проведенного методом ВЭЖХ представлены в таблице 1. 

Таблица 1.

Результаты количественного анализа британина и инучиненолида С во фракциях этанольного экстракта девясила британского Inula britannica L., проведенного методом ВЭЖХ*

*P=0,95

Сравнительный анализ хроматограмм показал, что предложенный метод фракционирования готового экстракта, позволяет получить очищенные суммы биологически активных соединений для биологических, фармакологических и медицинских задач. Причем, для практически полного извлечения инучиненолида С из спиртового экстракта, достаточно ограничиться элюированием хлороформом.

Заключение

Сочетанием методов экстракции и колоночной хроматографии на силикагеле, из цветков девясила британского выделены суммы, содержащие биологически активные сесквитерпеноидные лактоны британин и инучиненолид С.

Для их одновременного количественного определения в хлороформной и этилацетатной фракциях спиртового экстракта разработана сравнительно простая, быстрая и хорошо воспроизводимая методика ВЭЖХ анализа. Калибровочные прямые для обоих соединений, полученные в результате анализа 4 стандартных растворов, линейны в интервале концентраций 0,25-2,0 мг/мл (коэффициенты корреляции r³0.999). Время анализа составляет не более 10 мин. Разработанный ВЭЖХ метод позволяет с высокой точностью определять биологически активные сесквитерпеновые лактоны британин и инучиненолид С в цветках девясила британского.

В результате проведенных исследований установлено, что в хлороформной фракции этанольного экстракта цветков девясила британского содержится британина - 4,8%, инучиненолида С – 1,2%, тогда как в этилацетатной фракции – 4,4 и 0,24%, соответственно.

В пересчете на сухое сырьё (цветки) количественное содержание британина соответствует 0,19%, а инучиненолида С – 0,023%.

Таким образом, установлено, что цветки девясила британского являются перспективным источником не только британина, но и инучиненолида С.