Исследование органических компонентов Marrubium Anisodon

Введение

Растения рода Marrubium (Lamiaceae) [1,3] включают около 40 видов и довольно широко распространены в мире. Они произрастают в Европе, Азии, Южной Америке. В частности, Бразильские образцы хорошо изучены [1]. Некоторые виды растения ипользуются для лечения астмы, заболеваний лёгких, а также как обезболивающее средство. Среди химических компонентов обнаружены алкалоиды, дитерпены, стерины, фенилпропаноиды, флавоноиды. В связи с этим экстракты обнаруживают антимикробную активность против грамм-положительных бактерий и некоторые другие виды физиологического действия [4,5]. Особенно хорошо изучен вид Marrubium vulgare[2].

Объектом нашего исследования является Ферганский вид Marrubium anisodon C. Koch. (M.alternides Rech. Fill.) –– многолетняя трава. Шандра очереднозубая (рус) или “Қатортишли девортагиўт” (узб) встречается во многих частях света, в том числе в Центральной Азии. Ботаники характеризуют как сорное растение, произрастающее на каменистых склонах, злаково-разнотравных степях, а также в городах: вдоль заборов, арыков, на мусорных свалках, то есть повсеместно. Изученные нами образцы собраны в горной местности на высоте 3000 метров над уровнем моря.

В литературе имеются указания об обнаружении в составе растения аминоспирта холина, алкалоида стахидрина, витамина С, суммарных фракций флавоноидов, антоцианов, эфирного масла.

Сообщается о применении экстрактов из надземной части в народной медицине для лечения заболеваний горла и дыхательных путей посредством полоскания горла и полости рта; настойка обладает седативным, гипотензивным, гемостатическим действием.

Два указанных выше фактора, а именно: широкий ареал распространения и наличие полезных для человека свойств побудило нас провести более детальный анализ химических компонентов Шандры очереднозубой.

Экспериментальная часть

7,395 кг сухого размельченного до размера 1-3мм растительного сырья (надземная часть) Marrubium anisodon поместили в одну 20- и две 5-литровые колбы; заливали коммерческим 96%-ным этанолом, горло колбы закрывали корковыми пробками. После 2-х часового стояния часть спирта впиталась растением, поэтому добавляли экстрагент до покрытия слоя сырья; каждый слив проводили после суточного стояния, всего провели 6 сливов. Сливы проводили, надевая на горло бутылей двойной слой марлевой повязки. Одновременно экстракт пропускали через складчатый фильтр. Экстракты концентрировали на роторном испарителе, остатки собирали в предварительно взвешенный кристаллизатор, который помещали в вентиляционный шкаф. Собранный после отгонки растворителя спирт использовали для последующих экстракций. После отгонки последнего слива и добавления концентрированного остатка к предыдущим, кристаллизатор с суммой экстрактивных веществ держали в вытяжном шкафу несколько дней до постоянного веса.

Определение выхода экстрактивных веществ:

Масса кристаллизатора со смесью - 1450г

Масса кристаллизатора - 905г

Масса выделенной смеси - 1450-905=545г

Выход смеси по отношению к массе сухого сырья - 545/7395х100=7,3%.

ТСХ анализ полученной смеси.

На стеклянные пластинки размером 0,6 х 1,5 дм наносили коллоидный раствор, приготовленный из 10 г силикагеля и 32 мл насыщенного раствора гипса, после высушивания получали закрепленный слой силикагеля. Для приготовления систем использовали свежеперегнанные растворители. Полученные смеси анализировали также на незакреплённом слое окиси алюминия. Для незакреплённого слоя хорошие результаты получили в системах CCl₄:CHCl₃ - 4:1 и далее CCl₄: спирт и CHCl₃ : спирт в различных соотношениях. Качественные реакции на содержание низкомолекулярных биорегуляторов показали наличие в смеси алкалоидов и нейтральных веществ: кумаринов, флавоноидов, сапонинов и других тритерпеноидов.

Фракционирование полученной смеси.

Полученную выше смесь разделяли по общей методике, приведённой в предидущей главе: смесь растворяли хлороформе, а затем последовательно обрабатывали разбавленными растворами аммиака, щёлочи и кислоты, В остатке получили фракцию нейтральных веществ. Ниже приведены эксперименты по разделению алкалоидной и нейтральной фракций.

Разделение полученных фракций.

Фракцию нейтральных веществ промывали небольшим количеством дистиллированной воды, сушили над безводным сульфатом натрия, растворитель отогнали. Колонку диаметром 4 см и высотой 1,5 м заполняли окисью алюминия мокрым способом то есть в смеси с CCl₄. В течение 1 суток утрамбовывали колонку во избежании пузырьков воздуха внутри адсорбента, постукивая по колонке и промывая растворителем. Наутро 180 г природной смеси нейтральных органических компонентов растения растворили в минимальном количестве хлороформа, поместили в колонку, элюировали смесью CCl₄:CHCl₃ - 4:1. Фракции отбирали в стаканы по 0,2 л, сгущали _. до объёма 10 мл и собирали в снабжённые этикетками пенициллиновые склянки. По ходу разделения осуществляли контроль ТСХ. Далее, начиная с 21 фракции колонку продолжали элюировать с добавлением к используемой системе 1/20 часть (5%) этанола.

Начиная с 30-й фракции элюент окрашивается в жёлтый цвет, 30-35 фракции хроматографировали, а затем, ввиду их близости объединили. В ней содержатся три вещества с преобладанием одного. При стоянии сгущённого раствора выпадают бесцветные кристаллы вещества №1 в форме крупных игл, т.пл. 140^оС, хорошо растворим в CCl₄, плохо в большинстве других растворителей.

Следующие фракции 36-41 близки и содержат по 4 пятна.

Обсуждение результатов

Алкалоидную фракцию отделяли следующим образом: кислый экстракт перенесли в делительную воронку, соли алкалоидов разрушали добавлением разбавленной щёлочи, отделяющиеся основания экстрагировали дихлорэтаном, сушили над безводным сульфатом натрия, растворитель отгоняли. Получили 7,1 г смеси оснований, что составляет 0,09% от веса сухого сырья.

Хроматографическую стеклянную колонку с внутренним диаметром 3 см и высотой 1.2 м наполняли мокрым способом силикагелем с размером частиц адсорбента 100/400 мкм; столб силикагеля после утрамбовки занимал 2/3 высоты колонки. Сумму алкалоидов растворили в минимально возможном количестве дихлорэтана и поместили в колонку. Для элюции использовали свежеперегнанные растворители: гептан, ацетон, бензол, дихлорэтан, спирт.

Не допуская попадания в слой адсорбента воздуха, начинали вымывать колонку гептаном. Фракции собирали по 250 мл. Собрали 25 фракций. Фракции сгущали и каждую отдельно сливали в пенициллиновые склянки, снабжали этикетками.

Хроматографический контроль осуществляли на закреплённом слое силикагеля в системах гептан:ацетон – 9:1 (1) и бензол:этанол – 9:1 (2). Смесь алкалоидов до разделения содержит множество пятен от старта до фронта с преобладанием 1-2-х веществ. Отделённые на колонке силикагеля фракции анализировали методом ТСХ в системе 1. Первые 8 фракций близки и содержат 3 вещества. 9 – 14 фракции одинаковы, в иодной камере проявляется одно пятно с R_f 0,3; при стоянии выпадает осадок неидентифицированного вещества № 2, масса 3 мг, т.пл. 119 – 120^оС. Фракции 15 -17 одинаковы, но по составу сложнее предидущих: в ТСХ наблюдается по 4 пятна. Последующие 18 – 25 фракции тоже содержат по 4 - 5 пятен, но состав отличен от предыдущих фракций.

Поскольку последующие фракции не содержали пятен на ТСХ, продолжали элюирование колонки вначале чистым дихлорэтаном, а затем системой дихлорэтан: этанол – 9:1 и далее 8:2. Из последних фракций выделили вещество №3, т. пл. 225-226^оС (ацетон-этанол), идентифицированное со стахидрином.

Фракцию нейтральных веществ разделяли на колонке окиси алюминия, элюировали смесью CCl₄:CHCl₃ - 4:1. Далее, продолжали элюировать с добавлением 1/20 части этанола, близкие фракции объединили. При стоянии сгущённого раствора выпадают бесцветные кристаллы вещества 1 в форме крупных игл, хорошо растворимых в CCl₄, плохо в большинстве других растворителей. Из последующих фракций выделили незначительное количество вещества 2. Эти соединения охарактеризовали спектрально. Вещество1: М⁺346, состав С₂₀Н₂₆О₅; Вещество 2: М⁺360, состав С₂₀Н₂₄О₆. В ИК-спектре 1 имеются полосы поглощения О-Н (3466см^-1), С-Н (2939-2871), С=О (1741, соответствует как лактонному, так и сложноэфирному карбонилу); в области 1505 см^-1 имеется полоса, которая может быть отнесена фурановому циклу. В УФ-спектре, снятом в спирте, наблюдается полоса при 214нм (lgε 3,71), которую тоже можно отнести к фурану. Масс-спектрометрическая фрагментация 1 и 2 близка таковой перегринина и маррубина, содержащих в своей структуре цикл фурана. Таким образом, по предварительным данным кроме алкалоида стахидрина нами выделены нейтральные вещества перегринин и маррубин.