Вольтамперометрическое определение витамина В6 с использованием модифицированного стеклоуглеродного электрода

АННОТАЦИЯ

Представлен вольтамперометрический метод определения пиридоксина (витамина В₆) с использованием модифицированного гексациано-ферратом (II) хрома (III) в диапазоне концентраций пиридоксина 1,30-14,0 · 10^-6 М в фоновом электролите, содержащем 0,1 моль/л KCl. Предел обнаружения составил 0,4∙10^-6 моль/л. Определению не мешают равные концентрация цитрата натрия, бензоата натрия и витамина B₂; двукратное превышение концентрации маннита; почти десятикратное - витамина B₁₂, L-лизина и витамина B₁, а также до 50-кратной концентрации фруктозы. Только витамин С и кофеин представляли помехи при низких концентрациях пиридоксина.

Проведено апробирование разработанного метода и модифицированного стеклоуглеродного электрода в определении пиридоксина в витаминсодержащих фармпрепаратах.

ABSTRACT

A voltammetric method for the determination of pyridoxine (vitamin B₆) using of modified by chromium (III) hexacyanoferrate (II) in the range of pyridoxine concentrations of 1.30 - 14.0 • 10^-6 M in a background electrolyte containing 0.1 mol / l KCl was developed. The detection limit was 0.4 ∙ 10^-6 mol / l. The determination is not hindered by equal concentrations of sodium citrate, sodium benzoate and vitamin B₂; double the concentration of mannitol; almost tenfold - of vitamin B₁₂, L-lysine and vitamin B₁, as well as up to a 50-fold concentration of fructose. Only vitamin C and caffeine represented interference at low concentrations of pyridoxine.

Testing of the developed method and modified glassy carbon electrode in the determination of pyridoxine in vitamin-containing pharmaceuticals was carried out.

1. Введение

Из всех витаминов, относящихся к В группе, витамину В₆ – пиридоксину, отводится особая роль. Витамин В₆ способствует должному усвоению белка и жира; действуя как кофермент, отвечает за перенос аминокислотных групп и превращению триптофана – незаменимой аминокислоты – в ниацин; помогает предотвращать различные нервные и кожные расстройства и определенные типы анемии; способствует правильному синтезу нуклеиновых кислот, препятствующих старению; уменьшает ночные спазмы мышц, судороги икроножных мышц, онемение рук, определенные формы невритов конечностей; действует как натуральное мочегонное средство. Витамин В₆ может уменьшить потребность диабетиков в инсулине  [5; 6]. Очевидно, этот перечень может быть расширен.  

Известно, что витамин В₆,  находясь в виде соответствующего альдегида (пиридоксала) или в качестве первичного амина (пиридоксамина) или даже первичного спирта (пиридоксина) или его соответствующих форм 5-фосфатных производных [8] обычно является взаимоконвертируемым в организме [4].  При этом пиридоксин является наиболее стабильной формой этих соединений, что обусловливает ее применение в лекарственных препаратах [8].

Было разработано несколько методов для определения пиридоксина, включая высокоэффективную жидкостную хроматографию [14], хемилюминесценцию [16], обычную  и проточно-инжекционную спектрофотометрию [7; 12; 13]. Однако эти методы являются дорогостоящими и требуют дериватизации аналита.

В последние годы в научной литературе приводятся исследования в области вольтамперометрии, направленные на развитие методов определения витаминов в различных объектах с использованием модифицированных электродов. [1; 3; 11; 15].  Рабочие электроды подвергаются модификации для улучшения аналитического сигнала, диапазона обнаружения, чувствительности и селективности вольтамперометрического метода. При этом модификация их поверхности может быть осуществлена как с помощью органических, так и неорганических веществ. Из последних – предлагаются гексацианоферраты переходных металлов, обладающих каталитической активностью, например, гексацианоферрат меди (II) [17; 18]. Таким образом, использование электродов из углеграфитовых материалов, модифицированных комплексами гексацианоферрата, может быть полезным при определении различных витаминов, в частности, витамина В₆  - пиридоксина.

Целью настоящей работы является оценка возможности применения углеграфитого электрода, модифицированного гексацианоферратом Сr (III), для количественного определения витамина В₆ в лекарственных препаратах.  

2. Экспериментальная часть

Растворы и реактивы. Все растворы готовили с использованием дистиллированной воды с удельной электропроводностью не более 0,5 мкС/см и реагентов аналитической чистоты. Стандартный раствор пиридоксина  1,00 × 10^-3 моль / л готовили растворением гидрохлорида пиридоксина (Sigma-Aldrich    CAS 58-56-0) в 100 мл дистиллированной воды. Другие модельные растворы, используемые для изучения влияния аналитического сигнала индикаторного электрода на пиридоксин, также готовили растворением соответствующих реагентов в дистиллированной воде.

Оборудование. В работе был использован стеклоуглеродный электрод, диаметром 2,0 мм и длиной 15 мм с видимой поверхностью ~ 0,97 см² Модификацию поверхности электрода проводили по методике [19], для чего поступали следующим образом:

20 мл 0,1 М раствора KCl, подкисленного соляной кислотой до pH 3,0 и содержащего 1,0 × 10^-2 моль / л CrCl₃ • 6H₂O и 5,0 × 10^-3 моль/л K₃ [Fe (CN)₆] помещали в электрохимическую ячейку, снабженную электромеханической мешалкой и погружали подготовленный к модификации стеклоуглеродный электрод. Подготовка к модификации электрода заключалась в механической полировке поверхности электрода до зеркального блеска и последующей промывки дистиллированной водой. Излишнюю влагу с поверхности удаляли фильтровальной бумагой. Электрохимическая ячейка также содержала хлорид серебряный  насыщенный электрод сравнения ЭВЛ-1-М4 и вспомогательный электрод из платиновой проволоки, диаметром 0,3 мм.

Перед измерениями раствор в ячейке продували током аргона для удаления растворенного кислорода.

В качестве задающе-измерительного устройства использовали универсальный полярограф ПУ-1, подключенный к компьютеру посредством 8-битной звуковой карты [2]. Для электроосаждения гексациаоноферрата Cr(III) на поверхность стеклографитового электрода осуществляли многократную циклическую развертку потенциала в диапазоне

-0,3 - +1,0 V в течение 30 минут со скоростью развертки 50 мВ/сек. Затем, электрод обмывали небольшим количеством воды и оставляли в фоновом электролите – в 0,1 М растворе KCl, подкисленным соляной кислотой до рН =3.

Подготовка и анализ образцов лекарственных средств. В эксперименте использовались образцы фармпрепаратов импортного и отечественного производства: таблетки и растворы для инъекций, содержащие пиридоксин гидрохлорид.

Таблетки измельчали и растворяли в дистиллированной воде. Осадок удаляли фильтрованием. Отфильтрованный раствор собирали в мерную колбу и доводили объем до 100 мл  раствором фонового электролита, содержащего 0,1 М хлорида калия. С растворами для инъекций, поступали соответствующим способом, разбавляя содержимое ампулы (1 мл) фоновым электролитом.

Аналитический сигнал, обусловленный присутствием пиридоксина, оценивали по разности тока, наблюдаемого при 0,88 В на модифицированном стеклографитовом электроде в присутствии и отсутствии пиридоксина. Все измерения проводили не менее 3-х раз.

3. Результаты и обсуждение.

Уже отмечалось, что кроме пиридоксина, витамин В₆ может существовать в виде пиридоксаля, пиридитола, пиридоксамина, и других форм, образующихся также в организме в процессе метаболизма. Эти формы представлены на рисунке. 1

Рисунок 1. Структурные формулы метаболитов витамина В₆

В качестве лекарственного средства для внутреннего применения витамин В₆ используется в виде пиридоксина, что обусловлено наибольшей устойчивостью именно этой формы витамина в кислой среде желудочного сока. Поэтому нами была рассмотрена возможность вольтамперометрического определения именно пиридоксина.

Циклические вольтамперограммы, полученные на немодифицированном стеклографитовом электроде в присутствии индивидуальных растворов CrCl₃ и K₃ [Fe (CN)₆] приведены на рисунке 2.

Из рис. 2а видно, что на вольтамперограмме не обнаружено какого-либо пика, что указывает на отсутствие электрохимически активных  веществ. В то же время наличие двух пиков на циклической вольтамперограмме (Рис. 2б) гексацианоферрата (III) калия с максимумами 0,22 и 0,34 В, что соответствует окислительно-восстановительному процессу [Fe^II (CN) ₆]^4- / [Fe^III (CN) ₆]^3- [3,11].

                      а)                                                                                  б)

Рисунок 2. Циклические вольтаперограмммы для: (а) CrCl₃; (б) гекса-цианоферрат (III)  калия на стеклоуглеродном электроде в растворе электролита, содержащем 0,10 моль / л KCl. Скорость сканирования 50 мВ/сек.

Образование гексацианоферрата (III) хрома происходит по реакции:

CrCl₃ + K₃ [Fe (CN)₆] = Cr[Fe (CN)₆] + 3 KCl

В результате электрохимической активации на поверхности стеклографитового электрода образуется пленка KCr^III [Fe^II(CN)₆], которая будет играть роль медиатора переноса электронов.   

Механизм электроокисления можно представить известной схемой: медиатор М_red вступает в обратимую электрохимическую реакцию с образованием частиц М_ox, которые вступают в химическую реакцию с аналитом А, регенерируя медиатор М_red и образуя продукты реакции Р:

Регенерация частиц медиатора позволяет отнести этот процесс к каталитическому [15]. Экспериментально каталитический эффект проявляется в увеличении тока окисления медиатора в присутствии субстрата по сравнению с током, регистрируемым в его отсутствие.  На рисунке 3 представлена циклическая вольтамперограмма фонового электролита ( 0,1 М раствор хлорида калия, подкисленный до рН = 3) полученная с модифицированным электродом.  

Рис.3. Циклическая вольтамперо-граммма, полученная с использованием модифицированного стеклоуглеродного электрода в растворе электролита, содержащем 0,10 моль / л KCl. Скорость сканирования 50 мВ/сек.

Наблюдаемые пики 1 и 2 при 0,22 В и 0,88 В, соответствует K₂Cr^II[Fe^II(CN)₆] комплексным пикам окисления, в то время как их соответствующие пики восстановления (3 и 4) наблюдались при 0,82 В и 0,19 В соответственно. Таким образом, мы имеем Red-Ox системы [Cr^III-CN-Fe^II] / [Cr^II-CN-Fe^II] и [Cr^III-CN-Fe^II] / [Cr^III-CN-Fe^III].  Появление небольших пиков (5 и 6) может быть объяснено включением и удалением  катионов К⁺ во внешней координационной сфере [18].

Наиболее общая схема механизма Red-Ox процесса на модифицированном стеклоуглеродном электроде представляется следующим образом:

Прикладываемый начальный потенциал -0,2В обусловливает восстановление  Cr(III) до Cr(II) и к адсорбции K₂Cr^II[Fe^II(CN)₆]. Так как сканирование осуществляется в сторону более положительного потенциала, то происходит окисление металлов и соответственно, высвобождение ионов К⁺ и электрона. Переход ионов калия с твердой поверхности электрода (s)  в раствор (aq) и обратно, обусловливает  ионный поток, поддерживаемый фоновым электролитом, что, в свою очередь, обусловливает электронейтральность системы в целом. Таким образом, ионы К⁺ выполняют функцию противоиона. Доказательство этого можно найти в работе [17], в которой показано, что замена фонового электролита, содержащего хлорид калия на другой, например, на Na-ацетатный или фосфатный буфер, приводит к существенным искажениям вольтамперограмм.

Пик пиридоксина появляется в диапазонt 0,83-0,88 В и лучший вольтамперометрический профиль был получен в присутствии KCl. Использование других солей вместо хлорида калия приводит к менее выраженным вольтамперометрическим волнам, поскольку транспортировка через пленку в этом случае будет более сложной.

Измеряя разность аналитического сигнала, наблюдаемого в отсутствии и присутствии пиридоксина в анализируемом растворе, можно проводить количественное определение витамина В₆.

На рисунке  4  приводится зависимость аналитического сигнала при определении 5 мкМ/л пиридоксина от концентрации хлорида калия в фоновом электролите.

Из рисунка 4 следует, что лучший и более воспроизводимый аналитический сигнал наблюдается в диапазоне концентраций хлорида калия 0,05-0,1моль/л.

Влияние рН на величину аналитического сигнала модифицированного электрода оценивали в диапазоне рН 3,0-7,0 в растворе, содержащем 5 мкМ/л пиридоксина  (рис. 5). Можно заметить, что оптимальное значение pH для определения пиридоксина составляет 5,5.

Уменьшение аналитического сигнала при рН < 5,0 может объясняться конкурентным участием ионов H⁺ в кинетике взаимодействия между пиридоксином и модифицированной KCr^III[Fe^II(CN)₆] поверхностью электрода. Кроме того, при рН ниже 3,0 может происходить протонирование пиридина. При более высоких значениях рН может наблюдаться деградация витамина [9] и переход Cr(III) в форму хромового геля[10].

Рисунок 4. Влияние концентрации хлорида калия в фоновом электролите на величину аналитического сигнала	Рисунок 5. Влияние рН на аналитичес-кий сигнал модифицированного стеклоуглеродного электрода в присутствии пиридоксина.  Условия: 5 мкмоль/л пиридоксина, фоновый электролит 0,1 М KCl; скорость развертки потенциала 50 мв/сек.

Проведенный эксперимент послужил основанием для построения градуировочного графика на пиридоксин (рис.6). Градуировочный график был линеен в диапазоне концентраций пиридоксина 1,2∙10^-6 – 14,0∙10^-6 моль/л. Предел обнаружения составляет ~ 0,4∙10^-6 моль/л.

Рисунок 6. Градуировочный график на пиридоксин. (Условия в тексте)

Изучение влияния посторонних веществ на вольтамперометрическое определение витамина В₆ изучали введением в эталонный раствор, содержащий 5 мкмоль/л пиридоксина, веществ, традиционно сопутствующих в витаминсодержащих препаратах: гидрохлорид тиамина (витамин B₁), рибофлавин (витамин B₂), цианокобаламин (витамин B₁₂), цитрат натрия, бензоат натрия, маннит, фруктоза, L-лизин, аскорбиновая кислота (витамин C) и кофеин.

Результаты испытаний представлены в таблице 1.

Таблица 1

Влияние посторонних веществ на определение эталонной концентрации 5 ∙ 10^-6 моль/л пиридоксина  и их предельные концентрации

Как видно из полученных результатов на определение витамина В₆ с приемлемой метрологической характеристикой анализа (s_r < 0,05) не мешают равные концентрация цитрата натрия, бензоата натрия и витамина B₂; двукратное превышение концентрации маннита; почти десятикратное - витамина B₁₂, L-лизина и витамина B₁, а также до 50-кратной концентрации фруктозы. Только витамин С и кофеин представляли помехи при низких концентрациях пиридоксина. Это указывает на то, что разработанный вольтамперометрический метод имеет хорошую селективность для определения витамина В₆ и модифицированный стеклоуглеродный электрод может быть использован в анализе витаминсодержащих лекарственных препаратах.

Для подтверждения этого вывода разработанный вольтамперо-метрический метод и модифицированный электрод были апробированы в анализе фармацевтических препаратов, содержащих пиридоксин. Некоторые результаты анализа представлены в таблице 2.

               Таблица 2

Результаты определение пиридоксина в фармпрепаратах

Из результатов, представленных в таблице следует, что предлагаемый вольтамперометрический метод с модифицированным стеклоуглеродным электродом обладает хорошей точностью определения витамина В₆ в реальных объектах и может быть использован в анализе фармпрепаратов.

Анализ литературных источников также показывает, что чувствительность, воспроизводимость, точность определения витамина В₆ находятся практически в том же диапазоне, что и другие физико-химические анализа, превосходя их по экономичности и простоте [5, 17, 19].

Выводы

Разработан вольтамперометрический метод определения пиридоксина (витамина В₆) с использованием модифицированного гексацианоферратом (II)хрома(III) в диапазоне концентраций пиридоксина 1,30-14,0 · 10^{-6 М в фоновом электролите, содержащем 0,1 моль/л} KCl. Предел обнаружения составил 0,4∙10^-6 моль/л. Определению не мешают равные концентрация цитрата натрия, бензоата натрия и витамина B₂; двукратное превышение концентрации маннита; почти десятикратное - витамина B₁₂, L-лизина и витамина B₁, а также до 50-кратной концентрации фруктозы. Только витамин С и кофеин представляли помехи при низких концентрациях пиридоксина.

Проведено апробирование разработанного метода и модифицированного стеклоуглеродного электрода в определении пиридоксина в витаминсодержащих фармпрепаратах, показавшее хорошие метрологические характеристики метода.