Свойства бактериофагов Citrobacter

АННОТАЦИЯ

В статье представлены результаты исследований по индикации, идентификации, а также материалы по изучению биологических свойств бактериофагов, выделенных из объектов окружающей среды. Выделено 4 бактериофага - активных в отношении бактерий рода Citrobacter. Описаны результаты изучения их основных биологических свойств: морфологии негативных колоний; литической активности; спектра литической активности; специфичности действия; устойчивости к хлороформу и температурной устойчивости.

ABSTRACT

The article presents the research results according to the indication, identification, and materials for the study of biological properties of bacteriophages isolated from the environmental objects. Selected 4 bacteriophage active against bacteria of the genus Citrobacter. Describes the results of a study of their basic biological properties: morphology negative colonies; lysis; lytic spectrum of activity; the specificity of action; resistance to chloroform and temperature stability.

За сравнительно большой срок существования в качестве отдельной систематической группы, относительно экологии цитробактеров известно не очень много, что объясняется длительным отсутствием подборки дифференцирующих тестов. Очевидно то, что бактерии широко распространены в окружающей среде, так как их обнаруживают в самых разнообразных пищевых продуктах, воде, почве различных стоках. Цитробактеры выделяют из кишечника и мочевыводящих путей человека, лошадей, крупного рогатого скота, свиней, собак, грызунов, птиц, рептилий и насекомых [5 с.29, 8 с.75, 10. с.293, 11 с.188, 12 с.1789].

Заболевания, вызванные бактериями рода Citrobacter, или ассоциацией его с другими возбудителями болезней, могут возникать у рыб, домашних животных, диких животных, пчел. [5 с.30,12 с.1791]

Имеет также еще очень важное значение и то, что цитробактеры проявляют сравнительно высокую химиорезистентность. Наибольшую устойчивость к антибактериальным препаратам проявляет С. freundii (по сравнению с С. koseri и С. amalonaticus). С 90-х гг. XX века отмечен особенно быстрый её рост. Следовательно, возникает значительная проблема при лечении заболеваний, вызванных данным микроорганизмом – необходимо тщательнее подбирать антибактериальные вещества, а лучше подобрать альтернативные способы лечения и профилактики заболеваний с их участием.

Исходя из вышесказанного значение лечебных и профилактических мероприятий, связанных с выше названным патогеном приобретает все большее значение.

Цель исследования: провести индикацию и идентификацию вирулентных фагов бактерий рода Citrobacter в объектах окружающей среды.

Материалом для исследования послужили почва, вода открытых водоемов, сточные воды и песок.

В качестве индикаторных культур использовали бактерии рода Citrobacter (3 штамма), выделенные нами из патологического материала и пищевых продуктов.

При проведении исследований использовали питательные среды мясопептонный агар (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), 0,3%-ный, 0,7%-ный, 1,5%-ный; мясопептонный бульон ТУ 10-02-02789-176-94(ООО «БиоКомпас-С», РФ); висмут-сульфит агар (ФГБУН, ГНЦ ПМБ, РФ) и среда Эндо (ФГБУН, ГНЦ ПМБ, РФ).

Оборудование. Холодильники бытовые; микроскопы МБИ-6, ультратермостаты УТ-15У4,2; термостаты ТС-80М-2; центрифуги лабораторные ОПн-8УХЛ4,2 и ЦЛС-3; аппарат ультрафиолетового облучателя с лампой ДРБ8-18; колбы мерные; лабораторная посуда; стандарты мутности на 0,5 и 1,0 млрд. микробных клеток; фильтры фирмы Millipore (filter type: 0,22 μm GV).

Методы. При выполнении исследований применяли методы выделения бактериофагов из культур, описанные и использованные И.П.Ревенко [7 с.12]. Фаги выделяли из объектов окружающей среды методом, предложенным Адельсон [2 с.186]. Изучение биологических свойств и селекцию бактериофагов, а также повышение их литической активности проводили по методикам, предложенным М.Adams [1 с.521] и описанной в своих исследованиях С.Н. Золотухиным [4 с.58 ] и Пульчеровской Л.П. [6 с.73].  

Первым этапом наших исследований была попытка выделить бактериофаги Citrobacter из имеющихся полевых штаммов бактерий рода Citrobacter. Мы предполагали наличие лизогенных культур, а как известно из литературных данных такие бактериофаги обладают более выраженной специфичностью [3 с.9]. Вначале мы использовали методику выделения фагов без воздействия на них индуцирующего фактора, а затем с воздействием индуцирующего фактора, после чего фильтровали через фильтры фирмы Millipore (filter type: 0,22 μm GV). В качестве индуцирующего фактора применяли воздействие на бактерии ультрафиолетовых лучей в течение 30 секунд мощностью которой в области 254нм.

Полученный фильтрат на наличие фага исследовали на имеющихся культурах рода Citrobacter методом агаровых слоев. Результат получили отрицательный.

Свои исследования мы продолжили по методикам выделения фагов из объектов внешней среды, предложенной Гольдфарбом (1961) и описанные в диссертационных работах Золотухиным С.Н. (1996), Пульчеровской Л.П (2004) и Феоктистовой Н.А. (2006) и др.

Исследуемый материал засевали с индикаторными культурами в МПБ во флаконах создавая условия контакта индикаторных культур с искомыми бактериофагами. А именно во флакон, содержащий 0,5 литра мясопептонного бульона, добавили по 1,0 мл 18-ти часовых культур, всех имеющихся у нас штаммов Citrobacter. Флакон ставили в термостат при 37⁰С на сутки. Затем смесь бактерий центрифугировали при 2000 об/мин в течение 30 минут, фильтровали. Полученный фильтрат инактивировали от сопутствующей микрофлоры тремя способами:

- 1-й - прогревали при 60⁰С в течение 30 минут;

- 2-ой – обрабатывали хлороформом в соотношении 1:10 в течение30 минут;

- 3-й – очистку фагов осуществляли методом фильтрации с использованием мембранных фильтров фирмы Millipore (filter type: 0,22 μm GV). Наличие фага в фильтрате выявляли при его посеве на плотные питательные среды методом агаровых слоев.

В результате исследований 7 проб объектов окружающей среды удалось по указанной схеме выявить 4 изолята искомых бактериофагов (CIT-1, CIT-2 CIT-3 CIT-4) методом фильтрации. Результаты опыта представлены в табл. 1.

Таблица 1

Источники выделения бактериофагов Citrobacter

Селекцию штаммов бактериофагов производили методом пассирования штаммов на индикаторных культурах с последующим клонированием однородных негативных колоний, типичных для каждого изолята с периодической отвивкой типичных негативных колоний по методике, описанной и использованной Л.П. Пульчеровской [6 c.65], Н.А.Феоктистовой [9 c.6]. Делали до 6 пассажей.

Дальнейшей целью наших исследований было изучение биологических свойств фагов Citrobacter таких как: морфология негативных колоний; специфичность действия; литическая активность; диапазон литической активности; температурная устойчивость; устойчивость к хлороформу.

Морфологию негативных колоний изучали при посеве фага методом агаровых слоев по Грация на мясопептонный агар (МПА). После культивирования в термостате при температуре 37⁰С в течении 18-24 часов. В резльтате наблюдали - негативные колонии, которые были прозрачными, округлой формы с ровными краями от 1,5 до 5 мм. Результаты опыта представлены в таблице 2.

Таблица 2

Морфология негативных колоний выделенных бактериофагов

Активность выделенных бактериофагов определяли по методам Грациа и Аппельмана. 

Результаты определения литической активности выделенных бактериофагов представлены в табл. 3.

Таблица 3

Литическая активность

Для изучения спектра литической активности четырех полученных бактериофагов (CIT-1, CIT-2 CIT-3 CIT-4) мы использовали 3 штамма бактерий рода Citrobacter. Результаты опыта представлены в табл. 4.

Таблица 4

Спектр литической активности

Исследования показали, что изучаемые фаги лизировали все имеющиеся у нас культуры.

Определение специфичности выделенных бактериофагов проводили методом нанесения фага на газон роста бактериальных культур штаммов гетерогенных родов и видов.

В результате изучения специфичности выделенных бактериофагов рода Citrobacter (CIT-1, CIT-2 CIT-3 CIT-4) по отношению к представителям других Morganella, Escherichia, Salmonella, Proteus, Enterobacter, Klebsiella, Yersinia, получены из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ УГСХА (Proteus -14 штамма, Morganella - 7 штамма, Klebssiella - 12 штамма, Salmonella - 4 штамма, Y.enterocolitica - 6 штаммов). Результаты представлены в табл. 5.

Таблица 5

 Специфичность, выделенных бактериофагов

Примечания: “+” - лизис культуры; “-”  - отсутствие лизиса.

Установлено, что исследуемые бактериофаги не лизировали ни одну из испытуемых культур других родов бактерий. На основании полученных результатов можно сделать вывод, о том, что выделенные фаги является специфичными по отношению к бактериям рода Citrobacter и не активны в отношении представителям других родов бактерий.

Температурная устойчивость выделенных фагов бактерий рода Citrobacter

Температурную устойчивость выделенных объектов проводили по методикам, описанным в диссертационной работе Пульчеровской Л.П. [3 с. 80] путем прогревания в ультратермостате при температуре от 60⁰ до 90⁰С с интервалом 2-3⁰С в течение 30 минут. Результаты проведенных исследований представлены в табл. 6.

Таблица 6

Результаты определения температурной устойчивости бактериофагов Citrobacter

Из проведенных исследований видно, что выделенные и селекционированные фаги обладали примерно одинаковой температурной устойчивостью. Прогревание бактериофагов при температуре 60-68⁰С их активность оставалась неизменной. Далее при температуре 69-74⁰С активность понижалась на 2 порядка, при 75-80⁰С активность снизилась еще на 2 порядка, при 81-83⁰С активность фагов CIT-1 и CIT-2 понизилась до единичных негативных колоний, активность фагов CIT-3 и CIT-4 снизилась до1,5х10³ и 2,0х10² БОЕ соответственно. При температуре 84-90⁰С в 1 мл фаголизата активных корпускул фагов CIT-1, CIT-2 и CIT-4 не обнаружено. Фаг CIT-3 был незначительно активнее и наблюдались единичные активные корпускулы.

Устойчивость выделенных бактериофагов к воздействию хлороформа

Определение чувствительности к хлороформу выделенных фагов проводили путем обработки фаговой суспензии хлороформом в соотношении 1:10 при постоянном встряхивании в течении 10-40 минут с шагом в 10 минут. Результаты исследований представлены в табл. 7.

Таблица 7

Результаты определения устойчивости выделенных бактериофагов к хлороформу

Выделенные фаги CIT-1, CIT-2 и CIT-4 не обладали устойчивостью к хлороформу их активность снижалась уже через 10 минут на 40%, через 20 минут на 60% и через 30 минут активность названных фагов сохранялись не более 10% негативных колоний и через 40 минут наблюдали полную инактивацию фагов. Фаг CIT-3 на протяжении всего опыта сохранял свою активность на постоянном уровне. Результаты проведенных исследований представлен в таблице 7.

Выводы

1. Из объектов внешней среды было выделено 4 изолята вирулентных фагов, активных по отношению к бактериям рода Citrobacter.
2. Четыре селекционированных штамма фагов CIT-1, CIT-2, CIT- и CIT-4 имели титр по Аппельману от 3х10⁴ до 5х10⁸; по Грациа от 6х10⁵ до 3х10⁹. Выделенные и селекционированные бактериофаги лизировали все имеющиеся у нас штаммы бактерий рода Citrobacter.
3. Выделенные и селекционированные фаги бактерий рода Citrobacter обладали выраженной специфичностью к штаммам не лизировали представителей родов Morganella, Escherichia, Salmonella, Proteus, Enterobacter, Klebsiella, Yersinia; были устойчивы к нагреванию до 71⁰С в течение 30 минут. не обладали устойчивостью к хлороформу фаги CIT-1, CIT-2 и CIT-4 их активность снижалась уже через 10 минут на 40%, через 20 минут на 60% и через 30 минут названных фагов сохранялись не более 10% негативных колоний и через 40 минут наблюдали полную инактивацию фагов. Фаг CIT-3 на протяжении всего опыта сохранял свои свойства на постоянном уровне.
4. На основании проведенных исследований и полученных результатов, выделенный и селекционированный бактериофаг CIT-3, обладал свойствами, благодаря которым его можно использовать для дальнейшего изучения генома с целью создания терапевтического биопрепарата как альтернативы антибиотикотерапии.

Исследования проводятся при поддержке государства в лице ФГБУ «Российский фонд фундаментальных исследований» по научному проекту «Геномика и биология кандидатских бактериофагов для терапии энтеробактериальных инфекций в ветеринарной медицине» №16-44-732038/16 от 03.11.2016г.