Разработка новых методов бесприборной иммунодиагностики с использованием фотографической детекции результатов анализа

АННОТАЦИЯ

Рассмотрены варианты иммуноферментного анализа с использованием фотографической регистрации. Изучена возможность использования галогенид-серебряной поверхности фотоматериала в качестве «сухого» реагента для определения активности пероксидазы по каталитической реакции окисления гидрохинона перекисью водорода в присутствии фермента. При нанесении фермент-субстратной смеси на поверхность сенсибилизированного квантами света фотоматериала интенсивность почернения получаемых пятен находится в обратной зависимости от пероксидазной активности исследуемого препарата. При денситометрировании почернений предел обнаружения пероксидазы составляет ~1 нг/мл. С целью оптимизации условий для детектирования пероксидазной метки в иммуноферментном анализе изучен процесс проявления скрытого изображения на фотоматериале. Способ определения пероксидазы прост в исполнении, не требует дефицитных реактивов и может быть использован в иммуноферментных тест-методах для качественного и полуколичественного экспресс-определения ряда биологически активных веществ. Приводятся возможные схемы липосомного иммуноанализа с применением везикул, «нагруженных» маркером, поддающегося фотографической детекции.

ABSTRACT

The variants of enzyme multiplied immunoassay using the photographic registration are considered. The possibility of using a silver halide of the photographic material surface as a "dry" reagent is studied to determine a peroxidase activity according to catalytic oxidation reaction of hydroquinone by hydrogen peroxide in the presence of the enzyme. When applying the enzyme-substrate mixture on the surface of a sensitized photographic material by light rays, the blackening intensity of received spots is in inverse proportion to the peroxidase activity of the investigated drug. Under densitometry of blackening, the peroxidase detection limit is about 1 ng / ml. In order to optimize conditions for detection of the peroxidase label in the immunoassay, the process of the latent image manifestation on the photographic material is studied.  A method for determining peroxidase is simple-to-perform, does not require missing reagents and can be used in enzyme immunoassay methods for the qualitative and semi-quantitative express determination of a number of biologically active substances. The possible schemes of liposome immunoassay using vesicles "loaded" with the marker and subject to the photographic detection are provided.

Введение

Загрязнение окружающей среды веществами, обладающими антигенным воздействием на живой организм, ставят перед исследователями задачу разработки простых и специфических методов их определения, предназначенных, в первую очередь, для выявления и исследований загрязнений на уровне первой медико-санитарной помощи в полевых условиях [29]. Если большинство серологических тестов уже нашли свое применение в клинической и эпидемиологической диагностике, то иммунодиагностические методы исследования, основанные на специфическом взаимодействии антигенов и антител, только начинают использоваться в санитарно-гигиенической практике [12, 13, 18].

Это объясняется как самой спецификой проведения анализа, обусловленной большим разнообразием задач по иммунодиагностике и индикации биологических объектов, так и отсутствием необходимых тест-реагентов для проведения иммунотестирования. При этом индикация антигенного загрязнения окружающей среды не может быть решена с помощью какого-либо одного универсального метода и требует целый набор разнообразных тестов, поскольку параллельное исследование с использованием нескольких независимых методик значительно повышает достоверность полученных результатов [22].

В связи с этим проблема создания комплекса методов для обеспечения иммунохимического тестирования в слабооснащенных медицинских учреждениях или во внелабораторных условиях стоит весьма актуально.

Целью настоящего исследования является анализ возможностей методов иммунодиагностики с применением фотографической регистрации результатов анализа и выявление тенденций развития бесприборных методов, основанных на специфическом взаимодействии антиген-антитело.

Материалы и методы

В работе использовали препараты пероксидазы хрена фирмы “Reanal” (Венгрия) с RZ = 0,6. При изучении механизма и кинетики пероксидазных реакций использовали пероксидазу НПО «Биолар» с RZ = 2,9-3,2 активностью 820 ед/мг.

Для определения точной концентрации пероксидазы измеряли оптическую плотность водного раствора пероксидазы при λ_{403 нм} и с учетом коэффициента молярного поглощения рассчитывали концентрацию пероксидазы по эмпирической формуле: С = 0,44 · А, где А – оптическая плотность раствора. Растворы с меньшей концентрацией пероксидазы готовили ежедневно разбавлением исходного раствора пероксидазы. Перекись водорода, ос.ч. использовали без дополнительной очистки.

Для приготовления буферных растворов применяли фиксаналы соответствующих веществ.

Иммуноферментные диагностикумы и реактивы для проведения иммуноферментного анализа были предоставлены в наше распоряжение лабораторией ИФА института биохимии им А.Н. Баха РАН и совместным Российско-Швейцарским предприятием “DIAплюс”.

Концентрацию белка и пероксидазы в иммунопероксидазных конъюгатов контролировали спектрофотометрически при λ_{230 нм} и λ_403нм.

Перед проведением анализа предварительно проверяли иммунологическую активность используемых препаратов методом двойной диффузии в геле [12]. В качестве носителей для иммобилизации антител использовали микроплаты для иммунологическеих реакций с 96 лунками фирм “Dynatech”, “Cookmicrotitr” и «Медбиополимер» и пластиковые одноразовые пробирки. В работе использовали 0,05% и 0,2% растворы неионогенных детергентов: Тритон Х-100, Твин-80 и Твин-20, приготовленные на фосфатно-буферной смеси (0,01 М фосфатный буфер рН7,4 и 0,15 М NaCl).

Растворы гидрохинона готовили растворением в теплой дистиллированой воде кристаллов дважды возогнанного гидрохинона.

Дистиллированная вода, используемая в работе, имела удельную электропроводность не более 0,2 мкСименс/см.

Липосомы получали многократной экструзией фосфатно-буферного раствора дипальмитоил-фосфатидилхолина (ДПФХ) через поликарбонатные мембранные фильтры с диаметром пор 100 нм и обращения фаз. «Нагрузку» везикул липосом маркером (пероксидазой или гидрохиноном) осуществляли методом озвучивания при 22 кГц в течение 40 минут. Комплемент-зависимый лизис липосом проводили в присутствии комплемента морской свинки («Иммунопрепарат», Уфа) [9].

В работе использовали кварцевую, стеклянную и фторопластовую посуду, которую предварительно очищали концентрированной соляной и азотной кислотами (х.ч.) и тщательно промывали большими количествами деионизованной воды. Для приготовления эталонных растворов использовали мерную посуду 1 и 2 классов точности.

Отбор малых объемов жидкости (10-200 мкЛ) производили с помощью автоматических микродозаторов “Varipipette” (Польша) с погрешностью не более 2%.

Оптическую плотность растворов измеряли во времени на спектрофотометрах СФ-46 (ЛОМО, Санкт-Петербург) с использованием кварцевой кюветы с l=10,0 мм. Фотометрическая точность приборов составляла ±1% от величины оптической шкалы. Точность установки длины волны не менее ±0,3-0,4 нм.

В работе были использованы различные фотоматериалы отечественного и импортного производства (фотопленки, фотопластины, фотобумага). Оптическую плотность почернений на фотоматериалах оценивали визуально и с использованием микрофотометра МФ-2.

Интегральную засветку фотоматериала определяли с помощью люксметра Ю-116, путем расчета величины равной произведению освещенности, выраженной в люксах, на время экспозиции в секундах. Обработку фотоматериалов проводили обычным способом, описанным в руководствах по фотоделу [19].

Результаты и обсуждение

Иммунохимическим методам тестирования посвящено большое число обзоров, монографий и других публикаций, в которых рассматриваются многообразные способы постановки и проведения анализов [7, 16, 24].

Формулирование требований, предъявляемых к упрощенным иммунотестам, показывает, что идеальный диагностический тест должен быть чувствительным, специфичным, воспроизводимым, экспрессным, простым и недорогим [29].

Анализ процедуры выполнения ряда простых иммунодиагностических тестов показывает, что в настоящее время наиболее прос­тыми являются прямая агглютинация микроорганизмов и непрямая агглютинация частиц, покрытых, антигенами [12, 18]. Методы, основанные на использовании различных маркеров, позволяющих детектировать иммунохимические взаимодействия, являются основными диагностическими тестами, поддающимися метрологической аттестации и стандартизации. При этом твердофазный иммуноферментный метод (ИФА) анализа, на наш взгляд, остается единственным из них, который может быть модифицирован для использования во внелабораторных условиях [20, 26].

Твердофазный ИФА, известный как ELISA, предусматривает использование твердой фазы – иммуносорбента, в качестве которого выступают 96-лучночные планшеты.

Известны различные варианты проведения твердофазного ИВА [10, 23], принципы которых приведены в таблице 1.

Как следует из таблицы, различные схемы проведения ИФА включают иммунохимическое взаимодействие антигена и специфических антител в присутствии конъюгатов – специально синтезированных антител/антигенов – фермент-маркеров, с последующим определением остаточной активности фермента (в большинстве случаев пероксидазы из хрен ) связавшегося с твердой фазой иммуносорбента [14, 31, 33].

Таблица 1

Варианты и принципы проведения твердофазного ИФА

Примерами детекции фермента-маркера могут являться визуальная регистрация ре­зультатов анализа путем сравнения с окрашенными эталонами [21,25], ис­пользование портативных фотометрических [32, 33] и электрохимических анализаторов [3] и некоторые другие.

Для бесприборной регистрации результатов твердофазного иммуноферментного анализа нами предлагается использовать фотографические преобразователи информации [1, 4, 5].

При этом фотоматериал можно использовать двояко: по прямому назначению, т.е. для регистрации квантов света и в качестве "сухого реагента", позволяю­щего детектировать изменение концентраций веществ, воздействующих на фотоэмульсионный слой, содержащий галогенид серебра, в ходе ферментативной решении.

Первый путь успешно реализован в иммунолюминесцентном анализе

[32,35] для чего остаточную активность пероксидазы, связавшейся с иммуносорбентом, определяли по индикаторной реакции пероксидазного окисления производных люминола перекисью водорода:

HRP

LH₂ + H₂O₂                   →      L + 2 H₂O + hν

где LH₂ и L – восстановленные и окисленные формы люминола, соответственно; HRP – пероксидаза из хрена.

В результате реакции наблюдается свечение λ ~ 490 нм, хорошо различаемое в темноте невооруженным глазом. При исходных концентрациях перекиси водорода 10^-3 - 4·10^-4 М и люцеферина 10^{-4 М,} при которых наблюдалась максимальная скорость реакции, свечение развивалось уже на 2-3 минуте после начала реакции. В качестве детектора использовалась "сухая" фотопластинка фирмы "Polaroid" с чувствительностью 20000 ед ASA. В ходе анализа, подготовленный для регистрации иммуноферментных реакций планшет с 96-ю лунками поме­щали в камеру фотоаппарата "Polaroid" с предварительно вставленной фотопластинкой таким образом, чтобы светочувствительная поверх­ность фотопластинки была обращена к открытой поверхности планшета-иммуносорбента. Фотоматериал экспонировали 3-4 минуты, затем "сухая" пластинка извлекалась и полученное на ней изображение сопоставлялось с градуировочной шкалой [7, 8].

Второй путь использования фотоматериала в качестве "сухого" реагента основан на том, что многие каталитические процессы с участием оксидоредуктаз, в частности пероксидазы, сопровождаются изменением концентрации веществ, способных вступать в окислительно-восстановительные реакции с галогенидами серебра в экспонированном квантами света фотоэмульсионном слое [1, 27, 28].

В таблице 2 приведены вещества, участвующие в каталитических окислительно-восстанови­тельных реакциях и одновременно являющихся проявляющими агентами в растворах, используемых в фотоделе [9].

Как следует из количественных данных, приведенных в таблице, гидрохинон имеет невысокие каталити­ческие параметры, но обладает лучшим проявляющим действием. Поэтому, взяв его в качестве субстратной реакции для определения активности пероксидазы, целесообразно рассмотреть физико-химические процессы с участием ферментативной и фотохимической реакций.

То есть в процессе ферментативного окисления гидрохинона перекисью водорода его концентрация в растворе убывает, пропорционально активности пероксидазы, и после нанесения капли раствора на поверхность сенсибилизированного фотоматериала интенсивность почернения будет меньше, чем при нанесении на него раствора с исходной концентрацией гидрохинона.

Таблица 2.

Вещества, используемые в фотографии, которые могут являться субстратами в пероксидазном анализе

Химия процесса проявления

Видимое фотографическое изображение образуется в результате усиления скрытого изображения в процессе проявления фотоматериала. Коэффициент усиления этого процесса достигает 10⁶ – 10⁹ [17].

Развитие теоретических представлений о механизме образования скрытого изображения в значительной мере способствовали работы Чибисова и Митчелла [30].

В основу теории получения скрытого изображения положена гипотеза образования свободного серебра, но в виде включенных в микрокристаллы зародышей, вызывающих рост светочувствительности.

Схематически этот процесс может быть представлен следующим образом: квант света, попадая на кристалл галогенида серебра, выбивает электрон из иона галогенида. Электрон движется внутри кристаллической решетки до тех пор, пока не попадет на центр светочувствительности. На центре светочувствительности образуется атом серебра, что увеличивает степень дефекта участка кристалла, что, в свою очередь увеличивает вероятность захвата последующего электрона, выбиваемого другим квантом света [11].

nAg⁺ + ne^- → nAg⁰

Реакция проявления гидрохиноном бромида серебра может быть представлена следующим образом:

На этой стадии одна молекула гидрохинона восстанавливает два атома серебра, окисляясь до хинона. Образующийся хинон реагирует с сульфитом натрия, давая натриевую соль моносульфогидрохинона:

Моносульфогидрохинон в свою очередь способен восстановить еще два атома серебра, окисляясь до моносульфохинона:

Моносульфохинон, реагируя с сульфитом натрия, образует дисульфогидрохинон:

На этом процесс заканчивается, так как дисульфогидрохинон уже не в состоянии восстановить бромид серебра до серебра.

Образующаяся в результате этих превращений бромистоводородная кислота нейтрализуется щелочью, содержащейся в растворе:

4HBr + 4NaOH = 4NaBr + 4H₂O

Тогда суммарный процесс может быть представлен следующим стехиометрическим уравнением:

Таким образом, становится очевидным, что одна молекула проявителя – гидрохинона в присутствии сульфита натрия способна восстановить четыре атома серебра.

В ходе ферментативной реакции гидрохинон расходуется и, следовательно, во вторую, фотохимическую реакцию его вступит меньше.

После проявления пятна, интенсивность почернения которого обратно-пропорциональна активности пероксидазы, фотоматериал промывают и фиксируют обычным способом:

Na₂S₂O₃ + 2AgBr → Ag₂S₂O₃ + 2 NaBr

Фотометрируя пятна можно определить активность пероксидазы в исследуемом образце.

Исследование кинетики ферментативного окисления гидрохинона показало, что при концентрации перекиси водорода более 10^-3 М наблюдается ингибирование процесса, и порядок реакции по перекиси водорода -1, при концентрации Н₂О₂ менее 10^{-3 М} порядок реакции близок к 0, что объясняется конкурентным окисле­нием растворенным кислородом.

Порядок реакции по гидрохинону равен 1 во всем изученном диапазоне концентраций (10^-4-5·10^{-2 М)} [2]. С той целью, чтобы предотвратить окисление гидрохинона растворенным кислородом в реакционную смесь вводили сульфит натрия. Таким образом, мы получили реакционную смесь, по составу близкую проявляющей смеси, используемой в фотографическом деле. Поэтому дальнейшие исследования проводились с использованием фенидон-гидрохинонового проявителя.

Для проведения анализа в лунки с иммобилизованным иммунопероксидазным комплексом вводили 100 мкл 3·10^-3 М Н₂О₂ и 100 мкл раствора фенидон-гидрохинонового проявителя разбавленного дистиллированной водой в соотношении 1:5. Через 20 минут по 20 мкл смеси с помощью много­канального пипеточного микродозатора наносили на поверхность сенсибилизированного квантами света фотоматериала. По мере появления темных пятен (1,5-2 мин) фотоматериал промывали и закрепляли раство­ром, содержащим тиосульфат натрия. Интенсивность почернения пятен коррелирует с актвиностью пероксидазы.

На рис.1 (см. таблицу 3) приведена градуировочная шкала для определения концентрации пероксидазы. Минимально определяемая визуально концентрация пероксидазы около 2 нг/мл. С помощью микрофотометрирования возможно обнаружение 0,6 нг/мл.

В таблице 3 приведены значения интенсивности почернений пятен, полученных с помощью микрофотометра МФ-2.

Таблица 3.

Результаты измерения интенсивности почернений на фотоматериале при различных концентрациях пероксидазы

Разработанный метод детекции пероксидазы был нами апробирован на некоторых биологических объектах. В качестве контрольного метода использовали спектрофотометрический метод определения пероксидазы с использованием хромогенных субстратов: 5-аминосалициловой кислоты (5-АС) и TMB (3,3',5,5'-тетраметилбензидин) из коммерческих диагностических наборов совместного российско-швейцарского предприятия «DIA-плюс».

В процессе исследований была определена пероксидазная активность биологических жидкостей: слюна, сыворотка крови, в экстрактах растений (редис, помидоры, картофель, корни и листья хрена, огуречная кожура), в иммунопероксидазных конъюгатах (L-аспарагиназа – HRP, антитела к хориогонадотропина человека (ЧХГ), антитела против IgG-HRP [4].

Для определения пероксидазы в слюне и экстрактах растений, отобранные образцы подвергали центрифугированию на холоду в течение 25-40 минут при 12000 об/мин. Затем из центрифужных пробирок отбирали раствор и разводили его дистиллированной водой в зависимости от ожидаемой концентрации пероксидазы в 50-100 раз (иммуноферментные конъюгаты разводили в 500-1000 раз).

Определение пероксидазной активности биопрепарата проводили как описано в предыдущем параграфе при построении градуировочной шкалы на пероксидазу, беря вместо модельного раствора пероксидазы анализируемый раствор.

В таблице 4 представлены результаты определения пероксидазной активности в различных биопрепаратах.

В ходе исследований была рассмотрена возможность определения загрязнения окружающей среды ядохимикатами, некоторые из которых относятся к гаптенам, по ингибированию пероксидазы в реакции гидрохинон-перекись водорода. Было установлено, что пестициды, относящиеся к фосфорорганической группе: БИ-58, бутифос уже в разведении 1:2000 ингибирует пероксидазу с начальной активностью, соответствующей 25-30 нг/мл пероксидазы. Это при условии отработки методики взятия и отбора пробы позволяет определять остаточное количество ядохимикатов в смывах листьев и плодов растений, подвергнутых обработке пестицидами.

Таблица 4

Результаты определения пероксидазной активности некоторых биопрепаратов (Р=0,95; n = 5)

Полученные результаты позволяют допустить, что такой способ фотографической детекции и диагностические тест-системы на его основе могут быть использованы в иммуноферментном анализе. Из приведенных результатов следует, что наибольшее изменение оптической шкалы на пероксидазу наблю­дается в диапазоне концентраций пероксидазы 200-4,5 нг/мл, т.е. 5·10^-9 – 10^{-10 М.}

Учитывая стехиометрию взаимодействия меченого и немеченного антигенов с антителами в схеме конкурентного ИФА можно предположить надежное тестирование антигена в диапазоне 10^-9-10^{-10 М. [10]. Этот диапазон соответствует большому числу ис­пользуемых иммунотестов, например, для определения} IgG, гонадотропных гормонов, антител к лепре, эхинококку, лейшманиозу, маля­рии, вирусам сельско-хозяйственных культур, которые можно рассматривать как антигенные загрязнители окружающей среды [15].

Следует отметить, что модификация этого способа определения пероксидазной активности может привести к созданию диагностичес­ких полосок для качественного определения ряда биологически-актив­ных веществ [6].

К недостаткам гетерогенного ИФА, в первую очередь, следует от­нести длительность его проведения, что, в свою очередь, затрудняет его использование в экспресс мониторинге загрязнения окружающей среды. Техника же гомогенного иммуноанализа сложна и требует раз­деления прореагировавших с антителами меченного и немеченного ан­тигенов. В связи с этим нами рассмотрена возможность определения антигенов ИФА-методом с помощью маркеров, включенных в липосомы.

Липосомный иммуноанализ можно подразделить на две группы: не зависящие от комплемента и зависящие от комплемента [34].

В этих методах антитела (антигены) ковалентно связывают с по­лярным липидом, например с фосфатидилэтаноламином. Затем этот конъюгат вводят в состав мембраны при получении липосом, содержащих мо­лекулы фермента. Когда специфические антитела против лиганда образуют иммунологический комплекс с лигандом на поверхности липосомы, наблюдается лизис, усиливаемый системой комплемента. Принцип метода проиллюстрирован на рисунке. 2.

Рис.2. Схема иммуноанализа с использованием липосом, содержащих маркер и системы комплемента. Свободный антиген Аг_своб. конкурирует со связанным Аг_связ. за антитела Ат. Лизис липосом происходит в результате активации комплемента антителами, присоединившимися к их поверхности

Как видно из рисунка, свободный антиген конкурирует со связан­ными за антитела. Лизис липосом происходит в результате активации комплемента антителами, присоединившимися к их поверхности. При этом происходит высвобождение маркера, в нашем случае, гидро­хинона или пероксидазы, которую определяют вышеописанным способом.

Иммуноанализ на основе комплемента обладает 3-мя основными не­достатками [34]:

1. При получении липосом нужно строго нормировать содержание препарата, придающего им чувствительность к лизису. При этом наблюдается самопроизвольный лизис.

2. Для лизиса липосом необходимо сравнительно большие количества дорогостоящего комплемента.

3. Активация комплемента наблюдается через сравнительно большое время, приблизительно 20 минут, что отражается на экспрессности анализа в целом.

Эти недостатки могут быть устранены, если использовать липосомный иммуноанализ на основе цитолизина [320] . Схема этого иммуноанализа представлена на рисунке. 3.

Рис.3. Схема иммуноанализа с помощью маркера, включенного в липосомы, без использования системы комплемента. Свободный антиген конкурирует с конъюгатом (определяемое вещество – цитолизин) за связывание с антителами. При образовании комплекса с антителами конъюгат теряет способность разрушать липосомы

Свободный антиген конкурирует с конъюгатом (антиген-цитолизин) за связывание с антителами. При образовании комплекса с антитела­ми происходит ингибирование конъюгата и он теряет способность разрушать липосомы.

Важное преимущество этого метода состоит в том, что одни и те же липосомы можно использовать с разными конъюгатами, в частности, цитолизин-гаптен.

Для реализации предложенной нами системы фотографической детекции водное пространство липосом нагружается или непосредственно гидрохиноном, либо же пероксидазой хрена.

Возможности описанного здесь метода в настоящее время ограничены в виду того, что в продаже еще нет наборов для анализа с помощью липосом, нагруженных ферментами. Это объясняется, малодоступностью исходных веществ и сложностями крупномасштабного производства устойчивых к самопроизвольному лизису липосом. Тем не менее, очевидно, что отмеченные трудности могут быть преодолены и метод получит распростране­ние в практической медицине и экологии.

Повышение чувствительности и селективности иммунометрических методов контроля антигенных загрязнений может быть осуществлено благодаря применению моноклональных антител. При появлении банка клонов и их рассылки становится реальным получить моноклональные антитела в необходимых количествах практически в любой лаборато­рии и провести стандартизацию иммунодиагностических тестов. Сис­тема фотодетекции позволит применить иммунодиагностические тесты для оценки антигенного загрязнения окружающей среды с целью раз­работки мероприятий по ее оздоровлению.

Выводы

Проведенные исследования привели к следующим выводам:

1. Определение пероксидазной метки с помощью фотографических преобразователей информации, используемых в качестве «сухого» реагента с предварительной сенсибилизацией квантами света, отличается хорошей чувствительностью, специфичностью и простотой и может быть положено в основу регистрации результатов иммуноферментного анализа биологически активных веществ.

2. Формат использования твердофазного ИФА и липосомного иммуноанализа в определении антигенного загрязнения окружающей среды с фотографической детекцией способствует расширению аналитических возможностей бесприборных тест-методов иммунодиагностики.