Действие фракций красного пигмента, полученных с помощью анионообменной хроматографии, в системах in vitro и in vivo

I. Введение

Образование нерастворимых белковых отложений в тканях является диагностическим признаком целого ряда серьезных заболеваний человека различной этиологии: многочисленных губчатых энцефалопатий, болезни Альцгеймера, Гентингтона, Паркинсона, диабета II типа и др. [12, c. 1924]. Во многих случаях эти отложения формируются из упорядоченных образований, так называемых «амилоидов» [18, c. 262]. Морфологически амилоиды представляют собой линейные неразветвленные фибриллы длиной до нескольких микрометров и диаметром 10—20 нм, состоящие из отдельных протофиламентов, обогащенных β-структурами, расположенными перпендикулярно оси фибриллы [9, c. 2117]. Амилоидные фибриллы устойчивы к действию высокой температуры, денатурирующих агентов и к некоторым протеазам (химотрипсину и протеиназе К), а их способность специфически связывать некоторые низкомолекулярные соединения (Конго красный и тиофлавин T) широко используется для наблюдений за динамикой образования амилоидов в системах in vitro и в тканях млекопитающих [14, c. 1].

В настоящее время образование амилоидной фибриллы рассматривается как многостадийный процесс полимеризации, включающий реакцию нуклеации – сборки ядра полимера из нескольких растворимых белков с измененной конформацией [10, c. 1533]. Таким образом, в основе фибриллогенеза лежат нарушения фолдинга белков в результате мутаций, изменений pH и температуры, присутствия шаперонов, посттрансляционных модификаций.

Свой вклад в этот процесс при ряде патологий могут вносить свободные кислородные и азотные радикалы – супероксиданион, пероксидный радикал, пероксинитрит и др., при избыточном накоплении которых развивается окислительный стресс. Значительная роль этого патологического процесса подтверждена в развитии системных амилоидозов, болезней Альцгеймера и Паркинсона [5, с. 497]. Источником свободных радикалов, например, в ЦНС может служить микроглия [8, с. 2], также свободные радикалы накапливаются в клетке при запуске апоптоза.

Поиск веществ, влияющих на образование амилоидов, в настоящее время представляет несомненный практический интерес, так как частота амилоидных заболеваний в мире увеличивается, а эффективные препараты до сих пор находятся на разных стадиях разработки. Наиболее перспективными среди потенциальных лекарственных соединений в настоящее время считаются молекулы, способные подавлять путь фибриллогенеза, приводящий к накоплению токсичных интермедиатов [11, с. 136].

Ранее мы показали, что в клетках Saccharomyces cerevisiae, мутантных по генам ADE1 и ADE2 и вследствие этого накапливающих так называемый «красный пигмент», наблюдается снижение общего уровня белков в амилоидной форме (по сравнению с белыми изогенными штаммами). Нами установлено, что красный пигмент влияет на кинетику образования фибрилл инсулина in vitro, вероятно, в результате связывания красного пигмента с фибриллами, что препятствует их росту и влияет на образование агрегатов [2]. Показано действие красного пигмента на экспрессированный в клетках дрожжей β-амилоид человека – суммарное количество цитоплазматических включений в клетке и агрегирование в присутствии пигмента заметно снижается [13].

Красный пигмент дрожжей относится к группе N-гетероциклических пигментов, в которую входят пурины, птерины и их производные, он представляет собой комплекс полимеров 5-аминоимидазолрибонуклеотида, дополнительно содержащих аминокислоты [16]. Молекулярная масса полимеров препарата природного красного пигмента дрожжей колеблется в диапазоне 2–10 кДа. [1, c. 857]. Вопрос о том, можно ли выделить фракцию пигмента, обладающую наиболее выраженной противоамилоидной активностью, до сих пор остается открытым. Также не ясен механизм противоамилоидного действия красного пигмента в клетках – он может как тормозить формирование агрегатов, так и приводить к их ремоделированию или растворению. Кроме того, он может способствовать конверсии уже сформированных агрегатов в аморфную нетоксичную форму.

Таким образом, задачами настоящей работы стало изучение влияния фракций природного красного пигмента, полученных с помощью анионообменной хроматографии, на белок в модельной системе in vitro и на дрожжевые клетки. Изменения в процедуре выделения красного пигмента и данные о возможном механизме действия его наиболее активной фракции могут быть использованы при дальнейшей разработке лекарственной формы препарата.

II. Методика эксперимента

В настоящей работе использовали общепринятые обозначения генотипов и фенотипов штаммов S. cerevisiae (http: //www. yeastgenome. org/help/yeastGeneNomenclature. Shtml), а также стандартные среды для культивирования [15].

Пигмент выделяли из клеток штамма 23S (MATα ade2), любезно предоставленного А. Зехновым (Санкт-Петербургский государственный университет) на стационарной стадии роста (YEPD среда в течение 5 сут). Собранные клетки разрушали под действием температуры в лизисном буфере (25 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 100 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА). Остатки клеток удаляли центрифугированием (100 g, 1 мин). Надосадочную фракцию подвергали депротеинизации смесью хлороформ-метанол (3 : 7 об/об), выдерживали при 0 ⁰С в течение 10 мин и центрифугировали при 1000 g в течение 5 мин. После 2 депротеинизаций и удаления органических растворителей проводили инкубацию в растворе проназы (1 мг/мл) (Sigma, США) в Tris-HCl (0,1 M, pH 8,0) в течение 8 часов при 37 ⁰С. Далее проводили еще 2 депротеинизации для удаления проназы.

Выделенный исходный пигмент либо гидролизовали (далее обозначен Р_гидр), как описано в [1, c. 854], либо водный раствор красного пигмента наносили на колонку (1,5 × 5 см), содержащую анионообменную смолу DEAE-Sepharose Fast Flow (GE Helthcare, Великобритания), которую промывали 0,1 М водным раствором НCl. При прохождении колонки по значению рН и интенсивности окрашивания красный пигмент разделяется на 2 фракции: первой элюируется фракция с рН = 7,5 (далее обозначен Р₀), второй – фракция с рН = 2 (далее Р₁) в соотношении 3 : 1 по объему.

Полученные фракции (Р₁ предварительно нейтрализовали 1 M NaOH) наносили на колонки с Sephadex G-250 (GE Helthcare, Великобритания) для удаления низкомолекулярных примесей, после прохождения которых пигмент высушивали, а затем растворяли в деионизированной воде. Фракция Р₀ характеризуется собственным пиком флюоресценции в области около 520 нм (рис. 1) (длина волны возбуждения 450 нм). Чтобы сравнить действие разных форм пигмента, мы приблизительно выравнивали их по концентрации и использовали в опытах 1,8 мМ растворы.

Рисунок 1. Спектры собственной флуоресценции фракций красного пигмента Р1 и Р0, полученных с помощью анионообменной хроматографии, при длине волны возбуждения 450 нм.

Бычий сывороточный альбумин (БСА) (17 мкг в пробе) инкубировали в присутствии красного пигмента в течение 2 ч при 37 0С, после чего обрабатывали протеазой XIV типа из Streptomyces griseus (Sigma, США) (0,15 мкг/мкл пробы).

Для разделения агрегированных белков исполь­зовали электрофорез в 1,5 % агарозном геле, содержащем 0,1 % SDS (SFR agarose, Amresco, США)[6].

Цитотоксичность фракций красного пигмента и его способность индуцировать накопление свобод­ных радикалов оценивали методом проточной цитометрии на цитометре Coulter EPICS XL (Beckman Coulter, США), оснащенном аргоновым лазером (длина волны излучения 488 нм), при максимальной скорости подачи образца 1 мкл/с. Для оценки доли погибших клеток использовали йодистый пропидий (PI) – флуоресцентный краситель, проникающий в мертвые клетки и не окрашивающий живые [17]. Уровень окислительного стресса оценивали по накоплению активных форм кислорода (АФК), которое выявляли красителем 5 (6) — хлорметил-2,7-дихлордигидро флуоресцеин диацетатом (ДХДФДА).

Для статистической обработки данных и построения графиков использовали Excel 2010 (Microsoft, США). Достоверность различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

III. Результаты и обсуждение

Ранее в своих работах по действию природного красного пигмента на рост амилоидных фибрилл [1, 2, 13] мы показали, что красный пигмент препятствует связыванию специфического красителя тиофлавина Т с амилоидными фибриллами. Мы предполагаем, что это может объясняться прямой конкуренцией – красный пигмент блокирует сайты связывания тиофлавина Т на фибрилле, то есть можно представить, что пигмент выполняет роль «защитного покрытия». Мы попробовали определить в системе in vitro, является ли это протекторное действие строго специфичным для амилоидных фибрилл, или оно более универсально.

В качестве действующего агента выбрали сериновую протеазу из Streptomyces griseus, а в качестве модельного белка – БСА, для растворов которого характерно динамическое равновесие между мономерной и агрегированной (димерами, олигомерами и более крупными агрегатами) формами [4, с. 707]. Растворы БСА инкубировали с протеазой при 37 ⁰С в течение 2 ч с добавлением либо Р_гидр, либо фракций пигмента, полученных при анионообменной хроматографии, после чего пробы разделяли в агарозном геле. На рис. 2 при сравнении дорожек 1 и 2 хорошо видно, что за 2 ч протеаза полностью гидролизует БСА. Если к белку добавлены Р_гидр или Р₁, то гидролиз проходит лишь частично (дорожки 3 и 4, дорожки 5 и 6). Интересно отметить, что добавление к БСА самой фракции Р₀ вызывает олигомеризацию белка – белковая полоса на дорожках 7 и 8 более диффузна по сравнению с дорожкой 2, а гидролиз практически отсутствует (дорожка 8).

Рисунок 2. Модифицирующее действие различных форм красного пигмента на активность сериновой протеазы.

Дорожки: 1 – действие сериновой протеазы на альбумин; 2 – альбумин; 3 – альбумин с добавлением Р_гидр; 4 – действие сериновой протеазы на альбумин с добавлением Р_гидр; 5 – альбумин с добавлением фракции Р₁; 6 – действие сериновой протеазы на альбумин с добавлением фракции Р₁; дорожка 7 – альбумин с добавлением фракции Р₀; 8 – действие сериновой протеазы на альбумин с добавлением фракции Р₀.

Мы попытались также выяснить, какая именно часть молекулы полимера пигмента осуществляет защитную функцию. Для этого одновременно с фракциями красного пигмента мы проверили действие растворов рибозы и имидазола, взятых в эквимолярных концентрациях (0,05 М). На рис. 3 видно, что добавление к альбумину раствора имидазола вызывает ослабление гидролизной функции протеазы (дорожка 4), тогда как в присутствии рибозы альбумин гидролизуется полностью (дорожка 5).

Рисунок 3. Модифицирующее действие рибозы и имидазола на активность сериновой протеазы

Дорожки: 1 – альбумин; 2 – альбумин с добавлением имидазола; 3 – альбумин с добавлением рибозы; 4 – действие сериновой протеазы на альбумин с добавлением имидазола; 5 – действие сериновой протеазы на альбумин с добавлением рибозы.

Исходя из полученных данных можно предположить, что в клетке красный пигмент ассоциирует с белковыми молекулами за счет имидазольного кольца. Хотя это взаимодействие носит неспецифический характер, в клетке пигмент скорее всего локализован совместно с амилоидами [3, 209], что способствует именно его высокой противоамилоидной активности. Можно предположить, что механизмом этой активности является блокировка доступа к амилоидам ферментов протеолиза или белков, участвующих в посттрансляционной модификации. В результате красный пигмент опосредованно препятствует образованию наиболее токсичных для клеток олигомеров и способствует перенаправлению агрегации по неамилоидному пути

Одним из несомненно практически важных свойств красного пигмента является то, что он не обладает выраженной токсичностью для эукариот [13]. Фракции красного пигмента, полученные с помощью анионообменной хроматографии, оценили по показателям цитотоксичности с использованием проточной цитометрии. Растворы P₀ и P₁ добавляли в синтетическую питательную среду, содержащую галактозу, и культивировали клетки штамма VSY71 (W303-1A trp1-1::pRS304 TRP1+; ura3-1:: pRS306 URA3+) в течение 24 ч, после чего окрашивали PI и ДХДФДА. Результаты представлены на рис. 4. Можно видеть, что фракции Р₀ (б) и Р₁ (в) не вызывают изменений ни в уровне гибели клеток (верхний ряд), ни в количестве АФК (нижний ряд) по сравнению с контролем (а).

Рисунок 4. Цитотоксичность природного красного пигмента (а) и фракций Р0 (б) и Р1 (в) в отношении клеток штамма VSY71. Результаты окрашивания йодидом пропидия и ДХДФДА