Продукты твердофазного термического превращения L-α-аминокислот в вакуумированной системе

АННОТАЦИЯ

На основании хромато-масс-спектрометрического анализа установлены продукты термического превращения L-α-аминокислот в вакуумированной системе и предложена схема термопревращения аминокислот.

ABSTRACT

The process of thermodecomposition of L- α-aminoacids in vacuum has been investigated. The composition of the products was identified by chromatography-mass spectrometry and the scheme of the process was suggested.

Природные L-α-аминокислоты составляют многообразие органического мира. Общее число синтетических или включенных в природные соединения аминокислот исчисляется несколькими сотнями, и их число всё время растёт. Основным источником аминокислот для человека, служит белковая пища. В химических процессах, которые идут при высокотемпературной обработке продуктов питания, возможно образование самых разнообразных веществ. Естественно возникает вопрос, какие это вещества, нет ли среди них вредных для человеческого организма, и какова должна быть длительность термообработки белковой пищи, при которой возможно образование потенциально опасных для организма соединений [4].

Другим направлением исследования аминокислот является синтез биосовместимых и биодеградируемых олигомеров и полимеров на основе аминокислот [2]. И в случае термической поликонденсации α-аминокислот необходимо знать состав продуктов термического превращения аминокислот. Для термического превращения природных L-α-аминокислот в вакуумированной системе такой информации нет. Поэтому целью нашего исследования являлось установление состава  продуктов термического превращения L-α-аминокислот в вакуумированной системе.

В качестве объектов исследования выбраны L-α-аминокислоты, содержащие в составе R радикалы алифатического ряда (глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин), ароматического ряда (фенилаланин, тирозин), ОН – группу (серин, треонин), СООН – группу (аспарагиновая, глутаминовая кислота), NH₂CO – группу (аспарагин, глутамин), аминогруппу (лизин, аргинин), серосодержащие (метионин, цистеин, цистин) и азотсодержащие гетероциклы (пролин, гистидин, триптофан).

L-a-Аминокислоты – гетерофункциональные соединения, молекулы которых содержат одновременно амино- и карбоксильную группу у одного и того же a-углеродного атома. Это бесцветные кристаллы, растворимые в воде, некоторые из них слегка растворимы в этаноле, метаноле, ацетоне и нерастворимы в большинстве других растворителей. Все a-аминокислоты, за исключением глицина, проявляют оптическую активность, благодаря наличию хирального атома углерода. Такие молекулы несовместимы со своим зеркальным отражением любой комбинацией вращений и перемещений в трёхмерном пространстве [7,8]. Хиральные молекулы существуют в виде пар энантиомеров, различающихся только знаком оптического вращения, которое связано с их конфигурацией. Oни принадлежат либо к L-ряду (левовращающие), либо к D-ряду (правовращающие).

Молекулы аминокислот в кристаллическом состоянии и в растворе находятся в цвиттер ионной форме [3]:  

                              NH₂–CH(R)COOH   ⇄  N⁺H₃–CH(R)COO^-

Незаряженная форма (I) легко переходит в цвиттер-ион (II), что связано с выигрышем свободной энергии в 44,8 – 51,5 кДж/моль. Известно, что в вышеуказанном равновесии практически существует только цвиттер-ион (II). Например, для аланина соотношение (II):(I) = 260 000. Форма I существует в незначительном количестве в водных растворах. Помимо того, она присутствует в парах при сублимации аминокислот при высоких температурах. Например, в случае глицина соединение I было выделено вымораживанием на аргоновой матрице при 20К.       

Растворы аминокислот в воде проявляют буферные свойства в результате существования равновесия:

В твердом состоянии цвиттер-ионы аминокислоты образуют молекулярный кристалл с сильными водородными связями. Это объясняет довольно большие дипольные моменты аминокислот и дипептидов, их растворимость в воде, высокие температуры плавления. Цвиттер-ионная структура аминокислот подтверждается также полосой поглощения 1610-1550 см ^-1 в ИК-спектре твердой аминокислоты или ее раствора [1]. Структура кристаллических аминокислот и природа водородных связей в них обусловлена электронным строением их молекул, которые имеют значительные по величине эффективные заряды на группах СОО^- и ⁺NH₃.

Плавление кристаллических аминокислот сопровождается их разложением. Мы обратили внимание, что температура газовыделения летучих продуктов (Т_газ.) при нагревании аминокислот в вакуумированной системе существенно ниже температуры, которая фиксируется как температура плавления (Т_пл.) вещества [3]. Температура плавления (Т_пл.) и температура газовыделения (Т_газ.) при нагревании аминокислот представлены в таблице 1. Это позволило выбрать температурные интервалы для определения состава продуктов термопревращения. Продукты твердофазного термического превращения аминокислот представлены в таблице 2.

Таблица 1.

Температура плавления (Т_пл.) и температура газовыделения (Т_газ.) при нагревании аминокислот

Таблица 2.

Продукты твердофазного термического превращения аминокислот

Мы предполагаем, что причиной термического превращения аминокислот (глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин) в твердой фазе задолго до плавления кристаллов служит положение цвиттер-ионов в узлах кристаллической решетки. Электронейтральные цвиттер-ионы, несущие положительный и отрицательный заряды, локализованные на разных атомах, расположены в узлах кристаллической решетки подобно ионному кристаллу. Чем больше дипольный момент цвиттер-иона, тем больше энергия электромагнитного взаимодействия между цвиттер-ионами, тем выше скорость гетеролитической реакции конденсации, сопровождающейся образованием олигопептидов и отщеплением воды. Фактически кристалл аминокислоты – это единая система, в которой реакции конденсации происходят во всем объеме твердой фазы.

В зависимости от относительного положения цвиттер-ионов возможны реакции конденсации с образованием как линейных олигопептидов, так и циклических дипептидов. Для аминокислот глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин  и пролин были найдены производные дикетопиперазина. Для глицина, аргинина, лизина, триптофана, гистидина, пролина, метионина, цистеина, цистина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, аспарагина, глутамина  обнаружены низкомолекулярные олигомеры.

Реакции поликонденсации с образованием олигопептидов и циклов выражены в общей схеме:

Параллельно аминокислоты участвуют в реакциях декарбоксилирования и деаминирования:

При ином относительном расположении цвиттер-ионов в кристалле происходит, как мы установили при анализе продуктов реакции, образование циклических дипептидов:

замещенный 2,5-пиперазиндион

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Для выделения газообразных продуктов использовалась установка, описанная ранее [5,6]. В масс-спектрометрическую ампулу помещался стеклянный капилляр, содержащий 50-100 мг исследуемой кристаллической аминокислоты. Из ампулы откачивался воздух до давления 10 Па, она отпаивалась от вакуумной системы и помещалась в термостат при температуре опыта. После 1–3 часов выдержки в термостате ампулу извлекали из термостата, охлаждали до комнатной температуры и в отросток ампулы с разбиваемым кончиком помещался металлический боек. Отросток ампулы соединялся с вакуумной системой. После откачки промежуточных линий до давления 10 Па, соединительные линии заполнялись гелием, кончик ампулы разбивался при падении на него бойка, и ампула заполнялась гелием высокой чистоты марки М (99.9999%) до давления 1,5 атм. Для равномерного распределения продуктов реакции по объему ампулы она выдерживалась сутки при комнатной температуре. Заполненная гелием ампула через отвод фторопластового крана гибким шлангом подсоединялась к вакуумной системе через стеклянный корпус фторопластового крана, в котором вместо штока установлена прокалываемая резиновая пробка. Пробка прокалывалась иглой одноразового шприца объемом 2 мл. После откачки до давления 10 Па плавно открывался фторопластовый кран и под давлением смеси гелия и продуктов распада аминокислот шток шприца приходил в движение. По достижении торцом штока отметки 1 мл игла шприца удалялась из пробки, и шприц с образцом транспортировался к хромато-масс-спектрометру.

Состав газообразных продуктов реакции идентифицировали на хромато-масс-спектрометре TraceGCUltra/DSQII. Для идентификации летучих продуктов, имеющих низкую упругость пара при комнатной температуре, проводилось вскрытие ампулы, введение в нее жидкого растворителя и последующего анализа полученного раствора путем введения жидких проб в инжектор хромато-масс-спектрометра. Использовалась капиллярная колонка TR 5 MS длиной 30 м и диаметром 0,25 мм. Исходя из свойств анализируемых образцов, были выбраны следующие условия регистрации хромато-масс-спектрограмм: температура инжектора-200-250 ⁰С; скорость газа-носителя – 1 мл/мин, спллит потоков- 1/50. Температура колонки повышалась от 60 до 250⁰С со скоростью 10⁰ в минуту. Регистрировались масс-хроматограммы положительных ионов в диапазоне массовых чисел 12-200 (для определения содержания легких газов) и 35-300 (для остальных летучих продуктов). Идентификация компонентов смеси осуществлялась путем сравнения их масс-спектров с масс-спектрами электронной библиотеки NIST 2005.

Для обнаружения характеристических частот валентных колебаний твердых продуктов поликонденсации применяли спектрофотометр марки Shimadzu IR-Prestige-21/FTIR-8400S. Анализ полимеров методом времяпролетной МАLDI MS проводили на приборе Bruker Microflex LT в линейном режиме.

Таким образом, описана методика определения продуктов термического превращения L-аминокислот в вакууме. Впервые установлен состав продуктов термопревращения L-аминокислот в твердой фазе. На основании анализа продуктов предложена схема превращения L-аминокислот в вакуумированной системе.