Оптимизация методики получения человеческого белка Ku в Escherichia coli

Введение

Белок Ku является ДНК-связывающим белком. Ku преимущественно связывается сиквенс-неспецифично со свободными концами двуцепочечной ДНК, что определяет его основные  биологические функции в эукариотических клетках. В комплексе с каталитической субъединицей DNA-PKcs он формирует ДНК-зависимую протеинкиназу DNA-PK. В ее составе Ku отвечает за связывание с ДНК, которое активирует фосфорилирование белковых субстратов DNA-PK [4, p. 3460; 2, p. 17]. DNA-PK играет ключевую роль в клеточном ответе на появление двуцепочечных разрывов ДНК, которые способствуют генным транслокациям, но мешают нормальной репликации ДНК и вызывают апоптоз. Их репарация в основном происходит двумя способами: через гомологичную рекомбинацию или путем негомологичного объединения концов (NHEJ). Участие Ku в NHEJ является наиболее известной и изученной его биологической функцией. Ku связывает концы двуцепочечных разрывов в ДНК, что необходимо как для защиты концов от действия экзонуклеаз, так и для привлечения остальных компонентов комплекса репарации NHEJ [1, c. 568]. Также Ku участвует в различных других клеточных процессах, таких как V(D)J-рекомбинация, перестановка мобильных элементов генома, поддержание теломер, апоптоз, транскрипция [2, p. 20-23].

Белок Ku является гетеродимером и состоит из двух субъединиц массой примерно 70 кДа и 80 кДа, известных как Ku70 и Ku80. В клетках белковые субъединицы Ku70 и Ku80 находятся в виде очень прочного комплекса, который необходим для нормального функционирования белка. Гетеродимеризация Ku сильно стабилизирует обе субъединицы, препятствуя их деградации [5, p. 6881].

В связи с участием Ku во многих процессах для изучения его свойств и функций in vitro требуется препарат очищенного белка. Обычно его получают из ядерных экстрактов клеток млекопитающих. Это требует несколько стадий хроматографических очисток, после которых выход белка оказывается низким, кроме того такое получение дорогостоящее.   Очистка рекомбинантного His-6-меченного белка, продуцированного в клетках насекомых в бакуловирусной системе, позволяет получать белок с большим выходом, но требует конструирования бакмид, что заметно удлиняет процесс. В этой связи мы наладили процесс получения рекомбинантного белка Ku в прокариотической системе, позволяющий получать 0,2-0,4 мг белка из 1 л первоначальной культуры E. coli.

Результаты

Как отмечено выше, гетеродимер Ku состоит из субъединиц Ku70 и Ku80. Первоначально для получения гетеродимерного белка мы использовали подход, при котором выделяются отдельные субъединицы белка, а затем формируется гетеродимер. Однако такой путь не привел к успеху. Используя штамм E .coli BL21-CodonPlus, содержащий в геноме дополнительные копии генов тРНК к редким в E.coli кодонам, нам удалось наработать субъединицу Ku70, содержащую GST-метку на N-конце. Получить белок Ku80 не удалось по ряду причин: низкий уровень экспрессии, нерастворимость белка, значительный протеолиз.

С целью повышения растворимости белка Ku80 и уменьшения деградации Ku80 и Ku70, мы решили получать оба белка с одной плазмиды, с тем, чтобы они формировали гетеродимер непосредственно в клетке. Для этого сначала использовали вектор pETDuet-1, позволяющий ко-экспрессировать два гена с двух T7 промоторов. При этом первый белок (в нашем случае это Ku70) должен содержать 6xHis-метку на N-конце для очистки гетеродимера методом аффинной хроматографии на Ni-активированной агарозе. Тем не менее, ко-экспрессия генов двух белков не помогла избежать их протеолитической деградации и повысить растворимость, что особенно заметно в случае Ku80. Кроме того, нам не удалось добиться стабильной посадки на Ni-активированную смолу белка Ku70, а значит и всего гетеродимера (Рисунок 1).

Рисунок 1. Связывание гетеродимера Ku, экспрессированного с pET-Duet-1, с Ni-NTA-смолой

Вестерн-блот анализ с антителами на 6xHis-Ku70 (α-His) и Ku80 (α-Ku80). М – дорожка с маркерами масс (кДа). Дорожки, обозначенные ИПТГ -  содержат клеточный лизат после индукции транскрипции гена продуцируемого белка; осадок – осадок после центрифугирования клеток, разрушенных ультразвуком; проскок – белки, не связавшиеся со смолой; Ni-NTA-смола – смола со связавшимися после инкубации белками.

Есть только одна работа, в которой авторы получали рекомбинантный гетеродимер в бактериях и столкнулись с теми же проблемами, что и мы [3, p. 142]. Тем не менее, им удалось выделить гетеродимер Ku70/Ku80, используя бицистронную систему экспрессии, где кодирующие последовательности обеих субъединиц располагаются в одной мРНК в виде двух цистронов с внутренним сайтом посадки рибосом.

Мы сконструировали вектор для ко-экспрессии белков Ku70 и Кu80 с одной мРНК, аналогичный примененному в работе [3, p. 142]. В полученный ранее в нашей лаборатории вектор прокариотической экспрессии белка Ku70 с 6xHis-меткой на N-конце (на базе вектора прокариотической экспрессии pET-15b) было проведено клонирование гена Ku80 так, чтобы в результате транскрипции получалась бицистронная мРНК с внутренним сайтом посадки рибосом. При этом между двумя цистронами, кодирующими Ku70 и Ku80, находился линкер, содержащий последовательности Шайна-Дальгарно и A/U-богатую последовательность. Однако с такой конструкции нам не удалось получить экспрессию гена белка Ku80, стоящим вторым.

Была проведена оптимизация полученного вектора так, чтобы экспрессия белка, ген которого стоит вторым в бицистронной конструкции, была сравнима с экспрессией белка с первого цистрона (Рисунок 2).  В отличие от описанной в работе [3, p. 142] конструкции, наш новый вектор содержал последовательность Шайна-Дальгарно  и A/U-богатую последовательность, расположенные внутри 3'-конца первого цистрона (гена Ku70). При этом рамки считывания первого и второго цистрона перекрывались на 1 нуклеотид: старт-кодон Ku80 начинался внутри стоп-кодона Ku70 (последовательность TAATG). Такое взаимное расположение цистронов, последовательности Шайна-Дальгарно и A/U-богатой последовательности, согласно работе [6, p. 484], способствует повышению эффективности трансляции второго цистрона, и мы рассчитывали, что это позволит увеличить выход плохо экспрессирующегося белка Ku80.

Рисунок 2. Схема строения части вектора pET15b-bicis-Ku, кодирующей белки Ku70 и Ku80.