О роли серотонина в регуляции теплоустойчивости организма почвенной нематоды Caenorhabditis elegans

АННОТАЦИЯ

Исследована возможная роль серотонина в регуляции теплоустойчивости поведения C. elegans. Базовая теплоустойчивость поведения нематод может быть повышена тепловой закалкой (инкубация в течение 1 часа при 33°C с последующим восстановлением в течение 1 часа при 21°C) или двухчасовой преинкубацией при 30°C. Экзогенный серотонин в концентрации 2–8 мМ снижает базовую теплоустойчивость поведения, но не оказывает влияния на эффективность адаптации к экстремальной высокой температуре 36°C. Базовая теплоустойчивость нематод мутантной линии MT9772 (mod-5(n3314)), в организме которых повышено содержание эндогенного серотонина, ниже, чем у нематод линии дикого типа N2. Эффективность адаптации к гипертермии у нематод линии MT9772 (mod-5(n3314)) такая же, как у нематод линии N2.

ABSTRACT

The possible role of serotonin in the regulation of C. elegans behavior thermotolerance was investigated. The basic thermotolerance of nematode behavior can be increased both by heat hardening (1 hour of incubation at the temperature of 33°C followed by the recovery for 1 hour at the temperature of 21°C) and 2 hour of preincubation at the temperature of 30°C. Exogenous serotonin in concentrations 2–8 mM lowered the basic thermotolerance of behavior, but didn't affect the effectiveness of adaptation to extremely high temperature of 36°C. The basic thermotolerance of nematodes from the mutant strain MT9772 (mod-5(n3314)) with increased content of endogenous serotonin is lower than that of nematodes from the wild type strain N2. The effectiveness of adaptation to hyperthermia of nematodes from the mutant strain MT9772 (mod-5(n3314)) is similar with that of nematodes from N2 strain.

Температура является физическим фактором среды, оказывающим сильное влияние на все без исключения процессы, происходящие в организмах человека и животных на молекулярном и клеточном уровнях и на уровне целого многоклеточного организма [2; 5].

Основой существования пойкилотермных видов животных, у которых отсутствует система терморегуляции, являются произошедшая в ходе эволюции их организмов настройка на температурные параметры экологических ниш (физиологические оптимумы для этих организмов соответствуют температуре среды в период размножения) и стереотипные адаптивные изменения поведения и физиологического состояния, позволяющие выживание при экстремальном превышении физиологического оптимума температуры или, напротив, при температуре, которая значительно ниже этого оптимума [2; 5].

Известно, что мишенью действия экстремальной высокой температуры, нарушающей функции организма и вызывающей его тепловую смерть, в многоклеточных организмах пойкилотермных животных является нервная система [6–8]. Высокая температура, переносимая нейронами, нарушает процессы интеграции в нервной системе, осуществляемые быстрой синаптической трансмиссией, и ее модуляции биогенными аминами и нейропептидами. В то же время, высокая температура потенциально может нарушать все процессы интеграции функций нейронов, но вопрос о механизмах этих нарушений остается открытым. Ранее нами было показано, что в регуляции теплоустойчивости почвенной нематоды Caenorhabditis elegans может принимать участие серотонин [1], который в ее организме является не только нейротрансмиттером, но и нейромодулятором [4; 9]. Целью этой работы явилось исследование возможной роли серотонина в базовой теплоустойчивости C. elegans и в ее повышении тепловой закалкой организма и адаптацией к постоянной высокой температуре.

Материалы и методы

Эксперименты проводили с C.elegans линий дикого типа N2 и мутантной линии MT9772 (mod-5(n3314)), предоставленных Caenorhabditis Genetics Center. Нематод выращивали при 21°C в чашках Петри со стандартной средой выращивания нематод и  E.coli OP50 для кормления [3]. Нематод трехдневного возраста трижды отмывали 10 мл NG буфера (0,3 % NaCl, 1 мМ CaCl₂, 1 мМ MgSO₄, 25 мМ калийфосфатного буфера (pH 7,0)) и переносили индивидуально в пробирки с 1 мл NG буфера с добавлением серотонина креатинин сульфата или без него (контрольные эксперименты).

Для измерения теплоустойчивости C. elegans пробирки с нематодами переносили в ультратермостат TW-2.02 с температурой 36°C. Нарушения поведения, вызванные действием высокой температуры, регистрировали каждые 15 минут с использованием стереоскопического микроскопа SMZ-05. Регистрируемым нарушением поведения, вызванным гипертермией, являлся паралич нематод – полная потеря способности к плаванию, индуцированному механическим стимулом (встряхивание пробирки с червем). В качестве показателя теплоустойчивости поведения C. elegans использовалось среднее время экспозиции к постоянной температуре 36°C, необходимое для наступления паралича нематод.

Адаптацию нематод к действию экстремальной высокой температуры проводили их тепловой закалкой (инкубация в течение 1 часа при 33°C с последующим восстановлением в течение 1 часа при температуре 21°C) и двухчасовой экспозицией нематод к температуре 30°C. В этих экспериментах серотонин вводили в среду после адаптации, непосредственно перед измерением теплоустойчивости поведения.

В каждом варианте эксперимента использовано 30 червей. Эксперименты проводили в трех повторностях. Статистическую обработку результатов проводили с использованием углового преобразования Фишера φ*. В работе использовали реактивы фирмы Sigma. Высокие концентрации серотонина и никотина, использованные в работе, объясняются особенностью C. elegans как модельного организма, поскольку кутикула нематод обладает чрезвычайно низкой проницаемостью. Поэтому концентрации не только серотонина и никотина [9–10], но и большинства лекарств и токсикантов, эффективные для изменения поведения C. elegans, на порядки выше, чем у высших беспозвоночных.

Результаты и обсуждение

Устойчивость организмов беспозвоночных к действию экстремальной высокой температуры, как правило, описывается как базовая и индуцированная термотолерантность [5]. Базовая термотолерантность – это термотолерантность организма беспозвоночного, выращенного в оптимальных условиях среды. В свою очередь, индуцированная термотолерантность – это термотоле­рантность организма, повышенная его акклимацией к действию постоянной высокой температуры, которая превышает физиологический оптимум температуры, но переносима организмом [2], или тепловой закалкой, заключающейся в кратковременной экспозиции к сублетальной высокой температуре с последующим восстановлением при оптимальной температуре среды [5]. Генетические и физиологические механизмы базовой и индуциро­ванной термотолерантности организмов беспозвоночных различны [5].

Как показано в таблицах 1–2, введение серотонина в среду или повышение концентрации эндогенного серотонина в межклеточном пространстве мутацией гена переносчика серотонина mod-5(n3314) вызывают снижение базовой термотолерантности организма C. elegans. Это проявляется в уменьшении среднего времени экспозиции нематод к постоянной высокой температуре 36°C, которое вызывает тепловой паралич (полная потеря способности к плаванию, индуцированному механическим стимулом). Эти результаты находятся в соответствии с результатами нашей предыдущей работы [1], в которой показано, что серотонин снижает базовую термотолерантность C. elegans в результате активации рецептора серотонина SER-4.

Таблица 1.

Влияние тепловой закалки и действия постоянной высокой температуры на теплоустойчивость поведения нематод линии дикого типа N2
и мутантной линии MT9772 (mod-5(n3314))

Примечание: *** – достоверность разницы между линиями.

*** – p < 0,001.

Тепловая закалка повышает устойчивость организмов беспозвоночных экспрессией генов стрессовых белков (белки теплового шока, антиоксидантные белки и др.) [5]. Как показано в таблице 1, 60-минутная экспозиция C. elegans к температуре 33°C с последующим восстановлением нематод в течение 1 часа при температуре 21°C вызывает сильное увеличение среднего времени экспозиции к температуре 36°C, при которой нематоды сохраняют способность к плаванию, индуцированному механическим стимулом.

Таблица 2.

Влияние серотонина, тепловой закалки и действия постоянной
высокой температуры на теплоустойчивость поведения нематод линии дикого типа N2

Примечание: *** – достоверность разницы между контролем (среда без серотонина) и опытом (среда с серотонином). *** – p < 0,001.

••• – достоверность разницы между базовой теплоустойчивостью поведения и теплоустойчивостью после тепловой закалки. ••• – p < 0,001.

°°° – достоверность разницы между базовой теплоустойчивостью поведения и теплоустойчивостью после двухчасовой экспозиции к температуре 30°C. °°° – p < 0,001.

Увеличение теплоустойчивости поведения тепловой закалкой у C. elegans, так же, как у высших беспозвоночных [5], является следствием экспрессии генов стрессовых белков [6]. Как показано в таблице 1, тепловая закалка нивелирует различия теплоустойчивости между нематодами линии дикого типа N2 и мутантной линии MT9772 (mod-5(n3314)), проявляющиеся при измерении базовой теплоустойчивости поведения. Результаты этих экспериментов показывают, что увеличение концентрации серотонина во внутренней среде организма, вызванное мутацией гена переносчика серотонина, снижает базовую термотолерантность C. elegans без снижения термотолерантности, индуцированной экспрессией генов стрессовых белков.

Сходные результаты были получены в экспериментах, в которых сравнивалась эффективность тепловой закалки C. elegans при измерении теплоустойчивости поведения в среде без серотонина и в среде, содержащей серотонин (табл. 2). Серотонин снижает теплоустойчивость поведения как до тепловой закалки C. elegans, так и после нее, но экзогенный серотонин, снижая базовую термотолерантность поведения, не оказывает влияния на эффективность тепловой закалки C. elegans (табл. 2).

Ранее нами в экспериментах с C. elegans было показано, что организм этой нематоды может сравнительно быстро (1–2 часа) повышать свою резистентность к действию экстремальной высокой температуры в условиях действия на него умеренного теплового стресса, который является подпороговым для экспрессии генов стрессовых белков [6]. Как показано в таблицах 1–2, двухчасовая экспозиция C. elegans к постоянной высокой температуре 30°C, переносимой организмом, увеличивает устойчивость поведения к действию экстремальной высокой температуры 36°C. Наши эксперименты показали, что серотонин не снижает эффективность и этой адаптации к высокой температуре. Во-первых, после двухчасовой экспозиции нематод к температуре 30°C устойчивость нематод мутантной линии MT9772 (mod-5(n3314)) та же, что и у нематод линии дикого типа N2 (табл. 1).
Во-вторых, влияние этой экспозиции на теплоустойчивость нематод линии N2 проявляется в сходной степени при измерении теплоустойчивости в среде с серотонином и без серотонина (табл. 2).

Результаты наших экспериментов находятся в соответствии с общепринятыми представлениями о том, что молекулярные механизмы базовой и индуцированной термотолерантности у беспозвоночных различны [5].

Снижение серотонином устойчивости организма C. elegans к действию экстремальной высокой температуры, выявляющееся при измерении базовой термотолерантности, может объясняться двумя причинами:

1. Наиболее вероятным механизмом этого снижения является ингибирование серотонином секреции ацетилхолина нейронами. Известно, что у C. elegans серотонин регулирует секрецию ацетилхолина ее ингибированием [9]. В то же время дефицит ацетилхолина, обусловленный ингибированием его секреции при гипертермии, является одной из причин нарушения поведения C. elegans высокой температурой [7].

2. При оптимальных температурных условиях среды устойчивость организмов C. elegans к экстремальной высокой температуре ограничена, но может быть относительно быстро увеличена тепловой закалкой или умеренным повышением температуры (табл. 1). Серотонин в обычных условиях среды принимает участие во всех без исключения процессах регуляции функций организма C. elegans, таких как поведение, размножение, развитие и энергетический обмен [4], но в этих условиях он ограничивает устойчивость к гипертермии (табл. 2). Напротив, повышение устойчивости к гипертермии не зависит от концентрации серотонина (табл. 1–2), и это хорошо объясняется стратегией адаптации к экстремальной высокой температуре среды. Это приспособление происходит в условиях теплового стресса [5, 8], но из-за его высокой энергетической стоимости оно сопровождается прекращением репродуктивной функции организма беспозвоночного [2].

Выводы

1. Серотонин регулирует базовую термотолерантность C. elegans, вызывая снижение устойчивости поведения к экстремальной высокой температуре 36°C.

2. Серотонин не оказывает влияния на эффективность адаптации C. elegans к высокой температуре, происходящей как при тепловой закалке организма, так и при действии умеренно высокой температуры среды.