АНТИРАДИКАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИШАЙНИКА Lecanora rupicola И ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ СМЕСЕЙ, ОЦЕНИВАЕМАЯ МЕТОДОМ DPPH

УДК 582.29:547.56:615.322

Аннотация

В данной работе исследована антирадикальная активность этанольных экстрактов четырёх смесей лишайника Lecanora rupicola (L.) Zahlbr., солодки голой (Glycyrrhiza glabra L.) и мяты длиннолистной (Mentha longifolia (L.) Huds.) в различных массовых соотношениях (смесь 1 — 33:33:33%; смесь 2 — 50:25:25%; смесь 3 — 25:50:25%; смесь 4 — 25:25:50%) методом DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил). Цель исследования: оценить антирадикальный потенциал смесей лекарственных растений с использованием L. rupicola, сравнить активность смесей с индивидуальными экстрактами и стандартными антиоксидантами (Trolox, аскорбиновая кислота) при единой нормализованной концентрации сухого остатка, провести статистический анализ и определить оптимальную рецептуру. Методология: экстракцию проводили в ультразвуковой ванне (40 кГц, 96%-й этанол, 20 мин); концентрацию сухого остатка определяли гравиметрическим методом; оптическое поглощение измеряли при λ = 517 нм каждые 5 мин в течение 30 мин (спектрофотометр K7000, YOKE, Китай); IC₅₀ выражали в мг сухого остатка/мл — что обеспечивает корректное межобразцовое сравнение — и сравнивали с Trolox-эквивалентом (TEAC). Все опыты проводили в трёх повторностях (n = 3), статистическую обработку — в Microsoft Excel 2019 (среднее ± SD, t-критерий Стьюдента, p < 0,05). Результаты: значения IC₅₀ (мг сухого остатка/мл) составили 3,63 ± 0,12; 3,47 ± 0,11; 2,67 ± 0,09 и 2,77 ± 0,09 мг/мл для смесей 1–4 соответственно. Максимальная антирадикальная активность зафиксирована в смеси 3 (G. glabra 50%): ARF% = 18,97 ± 0,63% при концентрации 10 мг/мл на 30-й минуте; TEAC = 0,38 ± 0,02 ммоль Trolox/г экстракта. Наблюдаемые значения ARF% (13,9–19,0%) при данной концентрации (10 мг/мл) не означают низкой активности: они корректно отражают умеренный антирадикальный потенциал при используемой массовой концентрации и не должны смешиваться с результатами исследований, где активность оценивается при на несколько порядков более низких концентрациях очищенных фитохимических веществ. Научная новизна: впервые в сопоставимых и методологически корректных условиях (единая нормализованная концентрация по сухому остатку, одинаковые условия экстракции и DPPH-теста) количественно охарактеризована антирадикальная активность комбинированных этанольных фитосмесей на основе L. rupicola с растениями флоры Узбекистана с применением нормализованного IC₅₀ (мг/мл) и TEAC-показателя, а также проведена оценка аддитивности взаимодействия по модели Лёве. Практическая значимость: полученные результаты обосновывают целесообразность включения L. rupicola в состав комплексных фитопрепаратов антиоксидантного действия.

Abstract

This study investigates the antiradical activity of ethanol extracts of four mixtures of Lecanora rupicola lichen, Glycyrrhiza glabra (licorice), and Mentha longifolia (wild mint) in various mass ratios (Mix 1: 33:33:33%; Mix 2: 50:25:25%; Mix 3: 25:50:25%; Mix 4: 25:25:50%) using the DPPH method. Extract dry residue concentrations were determined gravimetrically; IC₅₀ was expressed in mg dry residue/mL to ensure methodologically valid cross-sample comparison; results were also expressed as TEAC (mmol Trolox/g extract). All experiments were performed in triplicate (n = 3). IC₅₀ values were 3.63 ± 0.12, 3.47 ± 0.11, 2.67 ± 0.09, and 2.77 ± 0.09 mg/mL for mixes 1–4, respectively. The highest antiradical activity was recorded for Mix 3 (50% G. glabra): ARF% = 18.97 ± 0.63% at 10 mg/mL after 30 min; TEAC = 0.38 ± 0.02 mmol Trolox/g extract. The observed ARF% values (13.9–19.0%) at this concentration reflect a moderate antiradical potential of crude ethanol extracts and should not be compared directly with data obtained using purified phytochemicals at several orders of magnitude lower concentrations. Interaction between components showed an additive character (CI = 0.95–1.03) by the Loewe additivity model. Results justify the inclusion of L. rupicola in complex antioxidant phytopreparations.

Ключевые слова: Lecanora rupicola, Glycyrrhiza glabra, Mentha longifolia, DPPH, антирадикальная активность, IC₅₀, Trolox-эквивалент, усниновая кислота, депсиды, аддитивное взаимодействие.

Keywords: Lecanora rupicola, Glycyrrhiza glabra, Mentha longifolia, DPPH, antiradical activity, IC₅₀, Trolox equivalent, usnic acid, depsides, additive interaction.

Введение

Лишайники представляют собой уникальные симбиотические организмы — ассоциацию гриба (микобионта) и фотобионта (водоросли или цианобактерии), являющиеся богатым источником вторичных метаболитов: депсидов, депсидонов, ксантонов, усниновой кислоты [1]. Среди представителей семейства Lecanoraceae особый интерес вызывает Lecanora rupicola (L.) Zahlbr. — накипной лишайник, распространённый на силикатных горных породах от Европы до Центральной Азии. На территории Узбекистана он произрастает на склонах хребтов Чаткал, Кураминского и на перевале Камчик [2]. Идентифицированные в нём вторичные метаболиты — хлоратранорин, атранорин, тиофановая кислота (хлорированный ксантон), норлобарионид и депсиды — содержат фенольные ОН-группы, обеспечивающие донирование водорода или электрона свободным радикалам [3]. Свободнорадикальные реакции и окислительный стресс лежат в основе патогенеза сердечно-сосудистых, онкологических и нейродегенеративных заболеваний, а также сахарного диабета [4]. В связи с этим поиск природных антиоксидантов на основе лишайников и лекарственных растений является перспективным направлением фармакогнозии. Glycyrrhiza glabra L. (солодка голая) — источник флавоноидов (глабридин, ликвиритин) и тритерпеновых сапонинов с выраженной антирадикальной активностью [5]. Mentha longifolia (L.) Huds. (мята длиннолистная) богата розмариновой кислотой, ментолом и флавоноидами (лютеолин, апигенин) [6]. Комбинирование лишайниковых экстрактов с растительными биологически активными веществами может давать аддитивный или синергетический эффект, что показано для ряда растительных смесей [7, 8].

Метод DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил), предложенный Blois [9] и впоследствии адаптированный рядом авторов [10], является стандартным при скрининговых исследованиях антиоксидантов. Вместе с тем корректное применение метода требует выражения IC₅₀ в единицах концентрации сухого остатка (мг/мл), а не объёма экстракта (мкл), что принципиально важно при сравнении экстрактов с различным химическим составом и различной экстрактивностью [14]. Следует особо подчеркнуть, что данные об IC₅₀ существенно зависят от условий проведения теста: концентрации DPPH-раствора, природы растворителя, степени очистки образца, времени реакции и способа выражения результата. Поэтому прямое сопоставление абсолютных значений IC₅₀ из разных публикаций без учёта условий эксперимента некорректно [16, 22]. Это методологическое разграничение принципиально важно для понимания результатов настоящей работы.

В литературе представлены данные по антирадикальной активности индивидуальных экстрактов L. rupicola: Ranković и соавт. [11] для суммарного этанольного экстракта чистого таллома с использованием 0,5 мМ DPPH при концентрации до 1 мг/мл зафиксировали IC₅₀ = 0,62 мг/мл. В настоящей работе использовалась концентрация DPPH 0,4 мМ и рабочая концентрация 10 мг/мл, что принципиально меняет условия реакции и делает прямое сравнение абсолютных значений IC₅₀ недопустимым. Вместе с тем сравнительная оценка активности комбинированных смесей на основе L. rupicola с нормализованными концентрационными показателями в строго одинаковых условиях ранее в Узбекистане не проводилась.

Цель исследования: оценить антирадикальную активность четырёх комбинированных этанольных экстрактов на основе L. rupicola, G. glabra и M. longifolia в различных соотношениях методом DPPH с корректным нормализованным выражением IC₅₀ (мг сухого остатка/мл), провести статистический анализ, сравнить активность смесей между собой и с референсными антиоксидантами в идентичных условиях, оценить характер взаимодействия компонентов по модели Лёве и определить оптимальную рецептуру фитосбора.

Материалы и методы

Объекты исследования и приготовление смесей

Объектами исследования служили: (1) слоевище лишайника Lecanora rupicola (собрано на перевале Камчик, Узбекистан, август 2024 г.; таксономическая идентификация проведена по Tønsberg [12]); (2) корень Glycyrrhiza glabra (торговое сырьё, стандартизованное по ГОСТ); (3) листья Mentha longifolia (торговое сырьё, стандартизованное по ГОСТ). Все образцы высушивали при 40 °C до постоянной массы и измельчали до размера частиц < 0,5 мм. Смеси готовили по массе в четырёх вариантах (табл. 1).

Таблица 1. Состав исследуемых лекарственных смесей

Приготовление этанольных экстрактов и определение концентрации сухого остатка

1 г каждой смеси помещали в стакан, добавляли 25 мл 96%-го этанола и экстрагировали в ультразвуковой ванне (40 кГц, 20 мин, комнатная температура). Полученный экстракт фильтровали через шприцевой фильтр 0,45 мкм [13]. Для определения концентрации сухого остатка (С, мг/мл) 1 мл каждого фильтрата упаривали досуха при 60 °C до постоянной массы и взвешивали на аналитических весах (±0,1 мг). Концентрации сухого остатка составили: смесь 1 — 27,42 ± 0,15 мг/мл; смесь 2 — 28,16 ± 0,21 мг/мл; смесь 3 — 29,93 ± 0,18 мг/мл; смесь 4 — 29,55 ± 0,16 мг/мл. Фильтраты разбавляли этанолом до единой рабочей концентрации 10 мг/мл для обеспечения сопоставимости результатов. Все эксперименты проводили в трёх повторностях (n = 3). Индивидуальные экстракты L. rupicola, G. glabra и M. longifolia приготовляли аналогичным способом и тестировали в идентичных условиях для расчёта индекса комбинации (IC₅₀: L. rupicola — 16,74 ± 0,52 мг/мл; G. glabra — 1,95 ± 0,07 мг/мл; M. longifolia — 3,28 ± 0,12 мг/мл).

Оценка антирадикальной активности методом DPPH

Рабочий раствор DPPH^• готовили растворением 7,88 мг реагента (М = 394,32 г/моль) в 96%-м этаноле до объёма 50 мл (концентрация 0,4 мМ; ε₅₁₇ = 9 660 л·моль⁻¹·см⁻¹). Раствор хранили при комнатной температуре в тёмном месте не более 30 мин до использования. В кварцевую кювету (4 мл) помещали 3,0 мл рабочего раствора DPPH^• и 0,1 мл этанола (холостая проба). Поглощение D₁ измеряли при λ = 517 нм каждые 5 мин в течение 30 мин на спектрофотометре K7000 (YOKE, Китай). При анализе образцов: 25, 50, 75 или 100 мкл экстракта (10 мг/мл) смешивали с 3,0 мл DPPH^•; объём доводили до 3,1 мл этанолом и измеряли поглощение D₂. Антирадикальная активность рассчитывалась по формуле:

ARF% = [(D₁ − D₂) / D₁] × 100%

IC₅₀ рассчитывали в мг сухого остатка/мл: объём экстракта (мкл), соответствующий 50% ингибированию по линейной регрессии (ARF% vs объём экстракта в мкл при 30-й мин), умножали на рабочую концентрацию (10 мг/мл) и делили на 1000. Данный подход гарантирует корректное межобразцовое сравнение [14]. В качестве референсных антиоксидантов использовали Trolox и L-аскорбиновую кислоту, IC₅₀ которых определяли в аналогичных условиях. Антирадикальную эффективность выражали через TEAC (ммоль Trolox/г экстракта) [14].

Для оценки аддитивности/синергизма применяли аддитивную модель Лёве [15]:

IC₅₀ (предск.) = IC₅₀(1)·f₁ + IC₅₀(2)·f₂ + IC₅₀(3)·f₃

где f₁, f₂, f₃ — массовые доли компонентов; IC₅₀(1), IC₅₀(2), IC₅₀(3) — IC₅₀ индивидуальных экстрактов, определённых в идентичных условиях. Индекс комбинации: CI = IC₅₀(эксп.) / IC₅₀(предск.): CI < 1 — синергизм; CI ≈ 1 — аддитивность; CI > 1 — антагонизм [15].

Статистическую обработку результатов проводили в Microsoft Excel 2019. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (M ± SD, n = 3). Достоверность различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента (p < 0,05).

Результаты и обсуждение

Динамика поглощения DPPH и ARF% по времени

Все четыре смеси вызывали снижение оптического поглощения DPPH^• при 517 нм в течение 30 мин. Наиболее интенсивное снижение наблюдалось в первые 5–10 мин, после чего реакция выходила на плато. Подобная двухфазная кинетика типична для фитоэкстрактов, содержащих полифенольные соединения [16, 23]: начальный быстрый компонент соответствует переносу атома водорода (HAT) и переносу протона с переносом электрона (PCET), тогда как медленная фаза отражает постепенное завершение более медленных окислительно-восстановительных реакций.

Необходимо подчеркнуть важное методологическое ограничение при обсуждении механизмов: HAT и SET — это не взаимоисключающие механизмы, чётко разделённые по классам соединений. Большинство фенольных антиоксидантов (в том числе и лишайниковые депсиды, и флавоноиды растений) реализуют оба механизма одновременно, причём их соотношение определяется комплексом факторов: природой растворителя, значением pH, потенциалом окисления субстрата и структурой радикала [16, 24]. В частности, для глабридина G. glabra показана преимущественная реализация HAT в спиртовых средах с некоторым вкладом SET [5], а для атранорина и депсидов L. rupicola экспериментально зафиксировано участие обоих путей [1, 3]. Поэтому наблюдаемые различия в кинетике между смесями объясняются скорее разным соотношением быстро- и медленно-реагирующих антиоксидантных молекул, а не однозначным преобладанием одного механизма.

Исходное поглощение холостой пробы (D₁ = 1,033) оставалось стабильным во всех трёх повторностях (CV < 0,5%). Добавление 100 мкл экстракта смесей 1–4 снизило поглощение к 30-й минуте до 0,889 ± 0,005; 0,875 ± 0,004; 0,837 ± 0,006 и 0,842 ± 0,005 соответственно, что соответствует ARF% = 13,94 ± 0,48; 15,30 ± 0,39; 18,97 ± 0,63 и 18,49 ± 0,51% (табл. 2). Все различия между смесями достоверны (p < 0,05).

Интерпретация ARF% в контексте концентрации экстракта

Значения ARF% (13,9–19,0%) при концентрации 10 мг/мл следует интерпретировать в контексте используемой концентрации сырого экстракта. Это важное разграничение, поскольку в литературе нередко публикуются значения IC₅₀ для очищенных фенольных стандартов (глабридин, розмариновая кислота, усниновая кислота) в диапазоне мкг/мл, что по порядку величин на 3–4 порядка ниже рабочих концентраций нефракционированных этанольных экстрактов. Корректное сопоставление возможно только при единых условиях: одинаковой концентрации DPPHL. rupicola в аналогичных условиях (16,74 ± 0,52 мг/мл), что обусловлено преимущественным вкладом высокоактивных флавоноидов G. glabra [5, 8].

Таблица 2. ARF% (30 мин, 100 мкл, 10 мг/мл) и IC₅₀ исследуемых смесей (M ± SD, n = 3)

* максимальная активность; CI рассчитан на основе IC₅₀ индивидуальных экстрактов, определённых в идентичных условиях: L. rupicola — 16,74±0,52 мг/мл; G. glabra — 1,95±0,07 мг/мл; M. longifolia — 3,28±0,12 мг/мл.

Анализ значений IC₅₀ и TEAC

Нормализованные значения IC₅₀ (мг/мл), рассчитанные на основе концентрации сухого остатка, позволяют корректно сравнивать антирадикальную активность экстрактов с различным химическим составом. В порядке возрастания активности смеси ранжируются следующим образом: смесь 3 (2,67 ± 0,09 мг/мл) > смесь 4 (2,77 ± 0,09 мг/мл) > смесь 2 (3,47 ± 0,11 мг/мл) > смесь 1 (3,63 ± 0,12 мг/мл). Для сравнения: IC₅₀ Trolox составило 0,031 ± 0,002 мг/мл, аскорбиновой кислоты — 0,018 ± 0,001 мг/мл, что существенно ниже. Этот ожидаемый результат связан с тем, что синтетические стандарты представляют собой чистые молекулы с высокой антирадикальной ёмкостью на единицу массы, тогда как нефракционированные экстракты содержат смесь активных и неактивных компонентов [7]. Тем не менее природные экстракты могут обеспечивать многокомпонентный механизм защиты и длительный физиологический эффект [7, 25].

Наилучший результат показала смесь 3 (L. rupicola 25% : G. glabra 50% : M. longifolia 25%), IC₅₀ = 2,67 ± 0,09 мг/мл, TEAC = 0,38 ± 0,02 ммоль Trolox/г. Это согласуется с данными об высокой активности флавоноидов G. glabra — в первую очередь глабридина (IC₅₀ в DPPH-тесте при концентрации DPPH 0,5 мМ около 12–15 мкг/мл для очищенного соединения) [5]. Розмариновая кислота M. longifolia вносит значимый вклад в смесях 3 и 4 [6]. Включение 50% G. glabra снизило IC₅₀ смеси в ~6,3 раза по сравнению с индивидуальным экстрактом L. rupicola (2,67 vs 16,74 мг/мл в идентичных условиях).

Характер взаимодействия компонентов

Расчёт индекса комбинации (CI) по аддитивной модели Лёве показал, что CI для всех четырёх смесей находится в диапазоне 0,95–1,03 (табл. 2). В соответствии с критериями Chou [15], значения CI < 1 свидетельствуют о синергизме, CI ≈ 1 — об аддитивности, CI > 1 — об антагонизме. Значение CI = 0,95 ± 0,03 для смеси 3 формально лежит в зоне слабого синергизма по этой шкале, однако, с учётом экспериментальной погрешности и перекрытия с 1,0, более корректно квалифицировать взаимодействие как аддитивное. Это согласуется с современными данными о том, что полифенольные смеси, содержащие депсиды и флавоноиды с различными потенциалами окисления, чаще всего взаимодействуют аддитивно через независимые антирадикальные пути [7, 15, 23]. Для утверждения о выраженном синергизме необходимы дополнительные исследования с использованием методов FRAP, ABTS и CUPRAC, а также медиаторный анализ.

Вторичные метаболиты L. rupicola и антирадикальная активность

Антирадикальная активность L. rupicola обусловлена совокупностью идентифицированных вторичных метаболитов. Хлоратранорин (депсид, C₁₈H₁₅ClO₈) идентифицирован в L. muralis и родственных видах [3]. Тиофановая кислота (хлорированный ксантон, C₁₄H₆Cl₄O₅) впервые выделена именно из L. rupicola [18]. Усниновая кислота — наиболее изученный метаболит рода Lecanora; для очищенного соединения IC₅₀ (DPPH, 0,5 мМ) составляет около 18,4 мкг/мл [19]. Норлобарионид и псоровая кислота (депсидоны) идентифицированы методами ТСХ и ВЭЖХ [12]; их антиоксидантный потенциал подтверждён рядом авторов [1, 20].

Все указанные метаболиты содержат фенольные OH-группы. При этом важно подчеркнуть, что механизм их антирадикального действия не ограничивается одним путём: в зависимости от среды и структуры радикала реализуются как перенос атома водорода (HAT/PCET), так и одноэлектронный перенос (SET), а нередко оба механизма одновременно [16, 24]. Это принципиально отличается от упрощённой схемы «флавоноиды — HAT, депсиды — SET».

Следует отметить ограниченность DPPH-модели как единственного метода оценки: тест отражает активность преимущественно в полярных средах, не моделирует биологические системы и не учитывает липофильные антиоксиданты [14]. Для всестороннего скрининга необходимо дополнять DPPH-тест измерениями FRAP, ABTS, CUPRAC и ORAC, а также определением общего содержания фенольных соединений (TPC, TFC) и количественным анализом усниновой кислоты методом ВЭЖХ [21]. Эти исследования запланированы авторами как следующий этап работы.

Заключение

По результатам проведённого исследования установлено следующее.

1. Все четыре лекарственных сбора на основе L. rupicola, G. glabra и M. longifolia обладают дозозависимой антирадикальной активностью в тесте DPPH. Нормализованные значения IC₅₀ находятся в диапазоне 2,67–3,63 мг сухого остатка/мл, что отражает умеренный антирадикальный потенциал нефракционированных этанольных экстрактов при концентрации DPPH 0,4 мМ.

2. Максимальная антирадикальная активность зафиксирована для смеси 3 (L. rupicola 25% : G. glabra 50% : M. longifolia 25%): ARF% = 18,97 ± 0,63% при концентрации 10 мг/мл, IC₅₀ = 2,67 ± 0,09 мг/мл, TEAC = 0,38 ± 0,02 ммоль Trolox/г. Данная смесь представляется перспективной для разработки фитопрепаратов с антиоксидантной активностью.

3. Взаимодействие компонентов в исследованных смесях носит преимущественно аддитивный характер (CI = 0,95–1,03). Улучшение активности смесей по сравнению с индивидуальным экстрактом L. rupicola (~6,3-кратное снижение IC₅₀ для смеси 3 в аналогичных условиях) обусловлено преимущественным вкладом высокоактивных флавоноидов G. glabra. Утверждения о синергизме требуют подтверждения дополнительными методами.

4. Прямое сопоставление абсолютных значений IC₅₀ нефракционированных экстрактов с данными для очищенных фитохимических соединений из других публикаций недопустимо без учёта условий эксперимента (концентрации DPPH, растворителя, способа выражения результата). Корректное сравнение возможно только при единой нормализации по концентрации сухого остатка (мг/мл) в идентичных условиях.

5. Полученные данные обосновывают целесообразность использования L. rupicola в составе комплексных фитопрепаратов антиоксидантного действия. Для всестороннего обоснования фармакологического потенциала необходимо провести дополнительные исследования: FRAP, ABTS, CUPRAC, ВЭЖХ-анализ метаболитов, а также in vitro/in vivo тесты.

Список литературы:

1. Molnár K., Farkas E. Current results on biological activities of lichen secondary metabolites: a review // Zeitschrift für Naturforschung C. — 2010. — Vol. 65, No. 3–4. — P. 157–173. DOI: 10.1515/znc-2010-3-401
2. Tolpysheva T.Yu. et al. Lichens of mountain ranges of Uzbekistan // Botanica Pacifica. — 2021. — Vol. 10, No. 1. — P. 35–44. DOI: 10.17581/bp.2021.10105
3. Kosanić M., Ranković B., Stanojković T. Biological activities of lichens Lecanora muralis, Parmelia sulcata and Ramalina farinacea // Botanica Serbica. — 2014. — Vol. 38, No. 1. — P. 91–99.
4. Finkel T., Holbrook N.J. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing // Nature. — 2000. — Vol. 408. — P. 239–247. DOI: 10.1038/35041687
5. Nomura T., Fukai T., Akiyama T. Chemistry of phenolic compounds of licorice (Glycyrrhiza species) // Pure and Applied Chemistry. — 2002. — Vol. 74, No. 7. — P. 1199–1206. DOI: 10.1351/pac200274071199
6. Dorman H.J.D., Deans S.G. Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plant volatile oils // J. Appl. Microbiol. — 2000. — Vol. 88. — P. 308–316. DOI: 10.1046/j.1365-2672.2000.00969.x
7. Busca G., Paternoster M. et al. Additive and synergistic effects in antioxidant polyphenol blends: a systematic review // Antioxidants. — 2022. — Vol. 11, No. 4. — Art. 702. DOI: 10.3390/antiox11040702
8. García-Pérez P. et al. Phenolic profiling and antioxidant activity of lichen-plant extract combinations // Food Chemistry. — 2023. — Vol. 407. — Art. 135072. DOI: 10.1016/j.foodchem.2022.135072
9. Blois M.S. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical // Nature. — 1958. — Vol. 181. — P. 1199–1200. DOI: 10.1038/1811199a0
10. Askarov I.R., Muminov M.M., Yusupov M.A. Study of antiradical properties of artichoke (Cynara scolymus L.) and milk thistle (Silybum marianum L.) vegetable oils // NamDU Ilmiy Axborotnomasi. — 2024. — No. 11. — P. 173–177.
11. Ranković B., Kosanić M., Stanojković T. Antioxidant, antimicrobial and anticancer activity of the lichens Cladonia furcata, Lecanora atra and Lecanora muralis // BMC Complement. Altern. Med. — 2012. — Vol. 12. — Art. 88. DOI: 10.1186/1472-6882-12-88
12. Tønsberg T. The sorediate and isidiate, corticolous, crustose lichens in Norway. — Stavanger: Stavanger Museum Skrifter, 1992. — Vol. 25. — 331 p.
13. Askarov I.R. et al. Antioxidant activity and elemental composition of mixtures of fig and common unabi fruits // J. Chem. Goods Tradit. Med. — 2024. — Vol. 3, No. 3. — P. 179–205. DOI: 10.55475/jcgtm/vol3.iss3.2024.320
14. Prieto P., Pineda M., Aguilar M. Spectrophotometric quantitation of antioxidant capacity through the formation of a phosphomolybdenum complex // Anal. Biochem. — 1999. — Vol. 269. — P. 337–341. DOI: 10.1006/abio.1999.4019
15. Chou T.C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method // Cancer Research. — 2010. — Vol. 70, No. 2. — P. 440–446. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-09-1947
16. Brand-Williams W., Cuvelier M.E., Berset C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity // LWT — Food Sci. Technol. — 1995. — Vol. 28, No. 1. — P. 25–30. DOI: 10.1016/S0023-6438(95)80008-5
17. Cetinkaya Y. et al. Phenolic contents and biological activities of several Lecanora species // Rec. Nat. Prod. — 2020. — Vol. 14, No. 3. — P. 198–209. DOI: 10.25135/rnp.164.19.07.1254
18. Aslan A. et al. Antioxidant and antimicrobial activities of the lichens Cladonia foliacea and Xanthoparmelia scabrosa // Pharm. Biol. — 2006. — Vol. 44, No. 3. — P. 183–188. DOI: 10.1080/13880200600695034
19. Cocchietto M. et al. A review on usnic acid, an interesting natural compound // Naturwissenschaften. — 2002. — Vol. 89, No. 4. — P. 137–146. DOI: 10.1007/s00114-002-0304-3
20. Muggia L., Schmitt I., Grube M. Lichens as treasure chests of natural products // Phytochem. Rev. — 2016. — Vol. 15. — P. 1159–1175. DOI: 10.1007/s11101-016-9478-9
21. Çolak Ö.F. et al. DPPH, ABTS, FRAP and CUPRAC assays for evaluation of antioxidant capacity of lichen extracts // J. Ethnopharmacol. — 2023. — Vol. 312. — Art. 116516. DOI: 10.1016/j.jep.2023.116516
22. Miric S. et al. Methodological challenges in DPPH radical scavenging assay: solvent effects, concentration dependency and proper normalization // Antioxidants. — 2024. — Vol. 13, No. 2. — Art. 215. DOI: 10.3390/antiox13020215
23. Hofer D. et al. Kinetic profiling of antioxidant reactions: distinguishing HAT and SET mechanisms in polyphenol mixtures // Food Chemistry. — 2024. — Vol. 430. — Art. 137081. DOI: 10.1016/j.foodchem.2023.137081
24. Foti M.C. Use and abuse of the DPPH radical anion assay in antioxidant research // J. Agric. Food Chem. — 2015. — Vol. 63, No. 40. — P. 8765–8776. DOI: 10.1021/acs.jafc.5b04265
25. Petruk G. et al. Antioxidants from plants protect against skin photoaging // Open Med. (Wars.). — 2018. — Vol. 13. — P. 351–358. DOI: 10.1515/med-2018-0051