ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ 1-(3,4-ДИМЕТОКСИФЕНИЛ)-6,7-МЕТИЛЕНДИОКСИ-1,2,3,4-ТЕТРАГИДРОИЗОХИНОЛИНА ГИДРОХЛОРИДА НА МОДЕЛИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ВОСПАЛЕНИЯ И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА УРОВЕНЬ НЕКОТОРЫХ ЦИТОКИНОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

УДК: 615.276:547.853.3:616-092.9

Аннотация

В данном исследовании была изучена противовоспалительная активность соединения 1-(3,4-диметоксифенил)-6,7-метилендиокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина гидрохлорид на модели экспериментального воспаления, вызванного формалином, а также его влияние на уровень некоторых цитокинов в сыворотке крови. Эксперименты проводились на беспородных белых крысах-самцах с массой тела 180–200 г. Экспериментальное воспаление было вызвано путём подкожного введения 2,5 % раствора формалина в подушечку задней лапы животных. Исследуемое соединение ввели животным внутрижелудочно в дозах 0,1; 0,5; 1,0; 5,0; 10,0 мг/кг. В качестве референс-препарата использовали диклофенак натрия. Результаты исследований показали, что тестируемое соединение проявляет противовоспалительную активность во всех испытанных дозах. Наивысшая фармакологическая эффективность наблюдалась в дозах 1,0 и 5,0 мг/кг, при этом противовоспалительная активность составила 77,5% и 78,5% соответственно. В ряде случаев эти показатели превосходили действие диклофенака натрия. Кроме того, соединение значительно снижало содержание IL-6 и TNF-α в сыворотке крови и нормализовало уровень IL-4.

Полученные результаты указывают на то, что соединение 1-(3,4-диметоксифенил)-6,7-метилендиокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина гидрохлорид оказывает выраженное противовоспалительное действие за счёт влияния на медиаторы воспаления и уровень цитокинов, которые указывают на целесообразность его углублённого изучения в качестве перспективного противовоспалительного средства.

Abstract

In this study, the anti-inflammatory activity of the compound 1-(3,4-dimethoxyphenyl)-6,7-methylenedioxy-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline hydrochloride, as well as its effect on the levels of certain cytokines in blood serum, was investigated in an experimental model of inflammation induced by formalin. The experiments were conducted on outbred white male rats weighing 180–200 g. The experimental inflammation model was established by subcutaneously injecting a 2.5% formalin solution into the hind paw pad of the animals. The test compound was administered intragastrically at doses of 0.1, 0.5, 1.0, 5.0, and 10.0 mg/kg. Diclofenac sodium was used as the reference drug. According to the results of the study, the test compound exhibited anti-inflammatory activity at all the tested doses. The highest pharmacological efficacy was observed at doses of 1.0 and 5.0 mg/kg, where the anti-inflammatory activity reached 77.5% and 78.5%, respectively. In some instances, these parameters exceeded the effect of diclofenac sodium. Moreover, the compound significantly reduced the levels of IL-6 and TNF-α in the blood serum and normalized the level of IL-4.

The obtained results demonstrated that the compound 1-(3,4-dimethoxyphenyl)-6,7-methylenedioxy-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline hydrochloride possesses pronounced anti-inflammatory properties through its influence on inflammatory mediators and cytokine balance, and substantiate the rationale for its further in-depth investigation as a promising anti-inflammatory agent.

Ключевые слова: 1-(3,4-диметоксифенил)-6,7-метилендиокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина гидрохлорид, противовоспалительная активность, формалиновая модель, цитокины, IL-4, IL-6, TNF-α, диклофенак натрия.

Keywords: 1-(3,4-dimethoxyphenyl)-6,7-methylenedioxy-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline hydrochloride, anti-inflammatory activity, formalin model, cytokines, IL-4, IL-6, TNF-α, diclofenac sodium.

Введение

Воспаление представляет собой сложную защитно-приспособительную реакцию организма, развивающуюся в ответ на инфекцию, травму, токсические вещества и другие повреждающие факторы, а также занимает важное место в патогенезе многих заболеваний. Согласно результатам современных исследований, хроническое воспаление считается одним из основных патогенетических факторов в развитии сердечно-сосудистых, аутоиммунных, метаболических, нейродегенеративных и онкологических заболеваний [1, 2]. В настоящее время значительная часть показателей инвалидности и смертности в мировом масштабе приходится на долю патологий, связанных с воспалением [3].

Несмотря на высокую терапевтическую эффективность использование широкое применение нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП) и глюкокортикостероидов, при лечении воспалительных заболеваний, ограничены проявлением ряда побочных эффектов при их длительном применении. В частности, повреждение слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, сердечно-сосудистые осложнения, нефротоксичность, гепатотоксичность, а также нарушение функции иммунной системы являются основными побочными эффектами данных препаратов [4]. В виду вышеизложенного, поиск новых противовоспалительных средств, обладающих высокой эффективностью и улучшенным профилем безопасности, остаётся одним из актуальных направлений фармакологии.

Результатами исследований молекулярных и клеточных механизмов воспалительного процесса, проведенных за последние годы установлено, что интерлейкины, фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), хемокины, а также другие медиаторы играют важную роль в возникновении и развитии воспалительной реакции [5, 6]. При этом как противовоспалительные цитокины IL-6 и TNF-α, так и противовоспалительный и иммунорегуляторный цитокин IL-4 играют ключевую роль в течении воспалительного процесса. В связи с этим, изучение изменений в уровне цитокинов приобретает важное научно-практическое значение при оценке противовоспалительной активности новых фармакологически активных соединений [7].

Азотсодержащие гетероциклические соединения, в том числе производные тетрагидроизохинолина, относятся к перспективным веществам с высокой биологической активностью. В литературе имеются сведения о том, что представители данного класса обладают низкой токсичностью, выраженными противосудорожными, антиоксидантными, нейропротекторными, анальгетическими, антиаритмическими, противоопухолевыми и противовоспалительными свойствами [8–13]. Однако противовоспалительная активность соединения 1-(3,4-диметоксифенил)-6,7-метилендиокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина гидрохлорид и его влияние на уровень цитокинов изучены недостаточно.

В виду вышеизложенного, оценка эффективности исследуемого соединения на модели экспериментального воспаления, вызванного формалином, а также его влияния на уровни цитокинов IL-4, IL-6 и TNF-α в сыворотке крови имеет важное теоретическое и практическое значение и может послужить научной основой создания противовоспалительных лекарственных средств нового поколения.

Цель исследования: изучение противовоспалительной активности соединения 1-(3,4-диметоксифенил)-6,7-метилендиокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина гидрохлорид на модели экспериментального воспаления, вызванного формалином, и его влияния на уровни цитокинов IL-4, IL-6 и TNF-α в сыворотке крови, а также оценка его фармакологической эффективности в сравнении с референс-препаратом диклофенаком натрия.

Материалы и методы

Оценка противовоспалительной активности соединения 1-(3,4-диметоксифенил)-6,7-метилендиокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина гидрохлорид и изучение его влияния на содержание некоторых цитокинов в сыворотке крови были проведены на беспородных белых крысах-самцах с массой тела 180–200 г. До начала эксперимента все животные в течение 7 дней содержались в условиях вивария и адаптировались к лабораторной среде. В период адаптации были полностью соблюдены стандартные требования, установленные для биоэкспериментальных исследований: температура в помещении поддерживалась на уровне 22±2 °C, смена света и темноты была организована по 12/12-часовому циклу. Животные имели свободный доступ к стандартному рациону и питьевой воде.

Дозы и способ применения исследуемого соединения были выбраны на основании требований руководства «Методические рекомендации по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [14, 15]. В ходе исследований строго соблюдались международные нормы биоэтики, все экспериментальные манипуляции выполнялись в соответствии с требованиями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов в научных и иных целях» (Страсбург, 1986) и Директивы ЕС 2010/63/EU [16, 17].

Для создания экспериментальной модели воспаления под кожу подушечки правой задней лапы животных вводили 0,1 мл 2,5 % раствора формалина. С целью изучения динамики изменений уровня цитокинов в сыворотке крови формалин в объёме 0,05–0,1 мл вводили под кожу бедренной области. Формалин, действуя как флогогенный фактор, усиливает высвобождение гистамина, серотонина, простагландинов и других медиаторов воспаления и вызывает развитие пролиферативной воспалительной реакции [18].

Подопытные животные были распределены по группам методом рандомизации. В интактную группу были включены здоровые крысы. Животным контрольной группы после индукции формалинового воспаления вводили 0,2 мл физиологического раствора. В качестве препарата сравнения использовали диклофенак натрия в дозах 8,0–10,0 мг/кг перорально. Крысам опытных групп соединение 1-(3,4-диметоксифенил)-6,7-метилендиокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина гидрохлорид вводили внутрижелудочно в дозах 0,1; 0,5; 1,0; 5,0; 10,0 мг/кг. Исследуемое соединение и референс-препарат вводили одновременно с формалином.

Степень выраженности воспалительной реакции оценивали онкометрическим методом с помощью плетизмометра (Ugo Basile, Италия). Объём лапы измеряли до и через 180 минут после введения формалина. Разница между этими показателями была принята в качестве основного критерия, отражающего интенсивность воспаления.

Кроме того, с целью выявления иммунологических изменений, происходящих в ходе воспалительного процесса, образцы крови забирали до начала эксперимента и по его завершении. В сыворотке крови определяли содержание интерлейкина-4 (IL-4), интерлейкина-6 (IL-6) и фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) и оценивали динамику их изменений противовоспалительных цитокинов IL-6 и TNF-α, а также противовоспалительного и иммунорегуляторного цитокина - IL-4. Концентрацию цитокинов измеряли методом иммуноферментного анализа (ИФА) на микропланшетном анализаторе производства Mindray MR-96A (Китай). В исследованиях использовали набор диагностических реагентов производства «Вектор-Бест» (Россия). Высокая чувствительность и специфичность использованного метода позволили провести достоверную количественную оценку уровней цитокинов.

Полученные результаты были статистически обработаны, данные представлены в виде M±m. Различия между группами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента, при сравнении нескольких групп использовали однофакторный дисперсионный анализ (One-way ANOVA). В качестве критерия статистической достоверности принимали значения p<0,05 и p<0,01. Данный статистический подход послужил обеспечению достоверности и воспроизводимости экспериментальных результатов.

Результаты исследований

 На модели воспаления, вызванного формалином, была изучена противовоспалительная активность соединения 1-(3,4-диметоксифенил)-6,7-метилендиокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина гидрохлорид. Полученные результаты были сопоставлены с референс-препаратом диклофенаком натрия.

В контрольной группе через 3 часа после введения формалина объём лапы увеличился с 1,0±0,6 мл до 1,8±1,3 мл, величина отёка составила 0,80±0,8 мл, или 80,0 %. Это свидетельствовало о развитии выраженной воспалительной реакции под действием формалина.

При применении референс-препарата диклофенака натрия в дозе 8,0 мг/кг отёк лапы составил 0,31±0,4 мл, противовоспалительная активность была равна 59,7 %. Доза препарата 10,0 мг/кг продемонстрировала ещё более высокую эффективность, снизив отёк лапы до 0,26±0,8 мл, противовоспалительная активность составила 68,2 %.

Новое исследуемое соединение 1-(3,4-диметоксифенил)-6,7-метилендиокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина гидрохлорид проявило противовоспалительную активность во всех испытанных дозах. При применении соединения в дозе 0,1 мг/кг отёк лапы составил 0,32±0,7 мл, противовоспалительная активность была равна 60,0 %. При повышении дозы до 0,5 мг/кг величина отёка снизилась до 0,24±0,6 мл, а активность препарата достигла 72,7 %. Наивысшая фармакологическая эффективность наблюдалась в дозах 1,0 и 5,0 мг/кг. В частности, в дозе 1,0 мг/кг отёк лапы составил 0,20±0,8 мл, противовоспалительная активность достигла 77,5 %, а в дозе 5,0 мг/кг отёк уменьшился до 0,19±0,4 мл, активность достигла 78,5 %. Данные показатели продемонстрировали статистически достоверное превосходство не только по сравнению с контрольной группой, но и по отношению к референс-препарату диклофенаку натрия (p<0,05).

Однако при повышении дозы до 10,0 мг/кг противовоспалительная эффективность препарата снизилась: отёк лапы составил 0,34±0,9 мл, а активность — 55,7 %. Это указывает на то, что оптимальный терапевтический диапазон доз для исследуемого соединения находится в пределах 1,0–5,0 мг/кг. Полученные экспериментальные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты исследований противовоспалительной активности соединения 1-(3,4-диметоксифенил)-6,7-метилендиокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина гидрохлорид в сравнении с диклофенаком натрия при формалин-индуцированном воспалении (M±m, n=6)

Примечание: a — достоверное различие по сравнению с контрольной группой, P<0,05; b — достоверное различие по сравнению с референс-препаратом, P<0,05.

Таким образом, полученные экспериментальные результаты показали, что соединение 1-(3,4-диметоксифенил)-6,7-метилендиокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина гидрохлорид обладает выраженной противовоспалительной активностью на модели воспаления, индуцированного формалином. Наивысшая эффективность зарегистрирована в дозе 5,0 мг/кг, при этом его действие превосходило терапевтическую эффективность референс-препарата диклофенака натрия.

На модели формалин-индуцированного воспаления было изучено влияние соединения 1-(3,4-диметоксифенил)-6,7-метилендиокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина гидрохлорид на уровень цитокинов в сыворотке крови. Результаты исследования продемонстрировали, что исследуемое соединение оказывает значительное влияние на уровень цитокинов, регулирующих воспалительный процесс.

В интактной группе животных физиологические уровни цитокинов IL-4, IL-6 и TNF-α составили 0,16; 0,31 и 0,65 соответственно. В контрольной группе животных, получавших формалин, содержание цитокинов был резко увеличено, и наблюдалась активация воспалительного процесса. В частности, было зафиксировано повышение уровня IL-4 до 2,0, IL-6 до 2,4 и TNF-α приблизительно до 3,1.

Диклофенак натрия, использованный в качестве референс-препарата, в дозах 8,0 и 10,0 мг/кг значительно нормализовал уровни цитокинов. Под действием препарата показатели IL-4 и IL-6 снизились, содержание TNF-α также достоверно уменьшилось по сравнению с контрольной группой (p<0,05).

Исследуемое соединение 1-(3,4-диметоксифенил)-6,7-метилендиокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина гидрохлорид проявило высокую биологическую активность во всех испытанных дозах. Доза соединения 0,5 мг/кг снижала уровень цитокинов: IL-4 до 0,47, IL-6 до 0,08 и TNF-α до 0,94. При повышении дозы до 1,0 мг/кг наблюдалась наивысшая эффективность: уровень IL-4 составил 0,50, IL-6 — 0,06, а TNF-α — 0,91. Данные показатели являлись статистически достоверно высокими не только в сравнении с контрольной группой, но в сравнении с референс-препаратом диклофенаком натрия (p<0,05).

Доза соединения 5,0 мг/кг также способствовала нормализации уровней цитокинов, однако её эффективность была несколько ниже по сравнению с дозой 1,0 мг/кг. Это указывает на то, что максимальная фармакологическая эффективность исследуемого соединения проявляется в диапазоне дозы 1,0 мг/кг. Полученные экспериментальные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Влияние исследуемого соединения на содержание цитокинов в сыворотке крови (M±m, n=6)

Примечание: a — достоверное различие по сравнению с контрольной группой, P<0,05; b — достоверное различие по сравнению с референс-препаратом, P<0,05.

Таким образом, полученные результаты показали, что соединение 1-(3,4-диметоксифенил)-6,7-метилендиокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина гидрохлорид обладает свойством нормализовать уровень цитокинов, играющих важную роль в воспалительном процессе. В особенности, соединение в  дозе 1,0 мг/кг продемонстрировало наивысшую биологическую эффективность, превзойдя по результатам действие референс-препарата диклофенака натрия. Это свидетельствует о том, что противовоспалительное действие данного соединения может быть связано с иммунорегуляторными механизмами.

Обсуждение полученных результатов

Результаты проведённых исследований показали, что соединение 1-(3,4-диметоксифенил)-6,7-метилендиокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина гидрохлорид проявил выраженную противовоспалительную активность на модели экспериментального воспаления, индуцированного формалином. Поскольку, что формалиновая модель широко применяется для оценки пролиферативной стадии воспаления и характеризуется усиленным высвобождением гистамина, серотонина, простагландинов и цитокинов, выявленная нами на данной модели фармакологическая эффективность, указывает на возможное влияние исследуемого соединения на синтез и высвобождение медиаторов воспаления.

Хотя все испытанные дозы соединения проявили противовоспалительную активность, наивысшая эффективность была зарегистрирована в дозах 1,0 и 5,0 мг/кг. В частности, в данных дозах наблюдалось значительное уменьшение отёка лапы и достижение противовоспалительной активности до 77,5–78,5 %. Эти показатели превысили эффективность референс-препарата диклофенака натрия. Увеличение же дозы до 10,0 мг/кг привело к снижению фармакологического эффекта. Данное обстоятельство указывает на существование оптимального терапевтического диапазона для этого соединения и на снижение фармакодинамического ответа при более высоких дозах.

С целью оценки молекулярных механизмов воспалительного процесса были изучены уровни цитокинов в сыворотке крови. В контрольной группе, получавшей формалин, резкое повышение содержания IL-6 и TNF-α подтвердило активацию воспалительной реакции. В группах же, получавших исследуемое соединение, наблюдалось значительное снижение уровней противовоспалительных цитокинов. В особенности в дозе 1,0 мг/кг уровни IL-6 и TNF-α снизились до минимальных значений, которые оказались ниже показателей референс-препарата. Это указывает на способность соединения регулировать воспалительный процесс посредством цитокинов.

Кроме того, нормализация уровня IL-4 свидетельствует о возможном наличии у исследуемого соединения также и иммунорегуляторных свойств, поскольку IL-4 в качестве противовоспалительного цитокина играет важную роль в регуляции активности макрофагов и ограничении воспалительной реакции. Поэтому влияние исследуемого соединения на уровень IL-4, IL-6 и TNF-α показывает, что его противовоспалительный эффект обусловлен не только симптоматическим, но и патогенетическим механизмом действия.

Полученные результаты подтверждают литературные данные о противовоспалительной активности производных тетрагидроизохинолина и расширяют перспективы применения соединений, относящихся к данному классу, в качестве новых фармакологически активных вществ. Результаты исследования показывают, что соединение 1-(3,4-диметоксифенил)-6,7-метилендиокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина гидрохлорид может быть рекомендовано для дальнейших доклинических исследований в качестве перспективного противовоспалительного средства.

Выводы

Соединение 1-(3,4-диметоксифенил)-6,7-метилендиокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина гидрохлорид проявило выраженную противовоспалительную активность на модели экспериментального воспаления, индуцированного формалином.

Наивысшая фармакологическая эффективность исследуемого соединения наблюдалась в дозах 1,0 и 5,0 мг/кг, при этом противовоспалительная активность составила 77,5 и 78,5 % соответственно и по ряду показателей превосходила действие референс-препарата диклофенака натрия.

Соединение значительно снижало содержание провоспалительных цитокинов — IL-6 и TNF-α в сыворотке крови и нормализовало уровень IL-4, указывающая на связь его противовоспалительного действия с иммунорегуляторными механизмами.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что соединение 1-(3,4-диметоксифенил)-6,7-метилендиокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина гидрохлорид может быть рекомендовано для дальнейших фармакологических и токсикологических исследований в качестве нового перспективного противовоспалительного средства.

Данные научные исследования выполнены в рамках бюджетного проекта Института.

Список литературы:

1. Medzhitov R. The spectrum of inflammatory responses // Science. – 2021. – Vol. 374, № 6571. – P. 1070–1075.
2. Meizlish M.L., Franklin R.A., Zhou X., Medzhitov R. Tissue homeostasis and inflammation // Annual Review of Immunology. – 2021. – Vol. 39. – P. 557–581.
3. Furman D., Campisi J., Verdin E. et al. Chronic inflammation in the etiology of disease across the life span // Nature Medicine. – 2019. – Vol. 25, № 12. – P. 1822–1832.
4. Barnes P.J. Targeting cytokines to treat asthma and chronic obstructive pulmonary disease // Nature Reviews Immunology. – 2018. – Vol. 18, № 7. – P. 454–466.
5. Nathan C. Nonresolving inflammation redux // Immunity. – 2022. – Vol. 55, № 4. – P. 592–605.
6. Netea M.G., Balkwill F., Chonchol M. et al. A guiding map for inflammation // Nature Immunology. – 2017. – Vol. 18, № 8. – P. 826–831.
7. Chen L., Deng H., Cui H. et al. Inflammatory responses and inflammation-associated diseases in organs // Oncotarget. – 2018. – Vol. 9, № 6. – P. 7204–7218.
8. Zhurakulov, S.N.; Vinogradova, V.I.; Levkovich, M.G. Synthesis of 1-aryltetrahydroisoquinoline alkaloids and their analogs.
8. Chem. Nat. Compd. 2013, 49, 70-74.
9. Fioranelli M., Roccia M.G., Flavin D., Cota L. Regulation of inflammatory reaction in health and disease // International Journal of Molecular Sciences. – 2021. – Vol. 22, № 10. – Article 5277.
10. Rakhmanova, K.A.; Zhurakulov, S.N.; Tursunkhodzhaeva, F.M.; Azamatov, A.A.; Saidkhodjayeva, D.M.; Jumayev, I.Z. Analgesic and Anti-Inflammatory Effects of 1-(4’-Dimethylaminophenyl)-6, 7-Dimethoxy-1,2,3,4-Tetrahydroisoquinoline Hydrochloride. Biomed. Pharmacol. J. 2022, 15, 891–895. https://doi.org/10.13005/bpj/2423.
11. Azamatov, A.A.; Zhurakulov, S.N.; Vinogradova, V.I.; Tursunkhodzhaeva, F.M.; Khinkar, R.M.; Malatani, R.T.; Aldurdunji, M.M.; Tiezzi, A.; Mamadalieva, N.Z. Evaluation of the Local Anesthetic Activity, Acute Toxicity, and Structure—Toxicity Relationship in Series of Synthesized 1-Aryltetrahydroisoquinoline Alkaloid Derivatives In Vivo and In Silico. Molecules 2023, 28, 477.
12. Azamatov A. A., Mamadaliev N. Z., Mandour A. A. Zhurakulov Sh. N., Aytmuratova U. K., Vinogradova V. I., Jalilov F. S.,  Tursunkhodzhaeva F.M. Anticonvulsant Potential of 1-Aryl-6,7-dimethoxy-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolines: Insights from Strychnine and Nicotine Models in In Vivo and In Silico Studies. Pharmaceuticals journal 18(9), 1350 https://doi.org/10.3390/ph18091350
13. Azamatov A.A., Tursunkhodzhaeva F.M., Zhurakulov Sh.N., Boboev Z.D., Kuchimov K.F., Aytmuratova U.K., Ortikov I.S., Abdurazakova R.Sh., Vinogradova V.I., Abdullaev I.Z., Gayibov U.G. Anti-Inflammatory Potential of 1-Aryl-6,7-Dimethoxy-1,2,3,4-Tetrahydroisoquinolines: Structure–Activity Relationship and
13. COX-2 Binding. Molecules 2026, 31, 1956. ttps://doi.org/10.3390/molecules31111956
14.  Khabrieva R.U. Guide to the Experimental (Preclinical) Study of New Pharmacological Substances. Moscow: Meditsina, 2005, 832 p.
15.  Stefanova A.V. "Preclinical Studies of Drugs", Kyiv: Avicenna Publishing House, 2002, Part I, p. 579. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes. - Strasbourg: Council of Europe, 1986.- 53 p.
16.  Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes // Official Journal of the European Union. - 2010. - L276. - P.33-79.
17.  Mironov A.N. Guidelines for conducting preclinical studies of medicinal products. Part 1. Moscow: Grif i K, 2012, p. 673.