СИНТЕЗ НОВОГО ПРОИЗВОДНОГО 5-ФТОРУРАЦИЛА НА ОСНОВЕ 3-ЭТИЛАНИЛИНА И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

АННОТАЦИЯ

В данном исследовании было синтезировано новое соединение путем реакции продукта хлорацетилирования 3-этиланилина с 5-фторурацилом. Процесс проводился в 2 этапа: сначала была выполнена реакция хлорацетилирования 3-этиланилина, а затем синтезирован новый продукт на основе реакции полученного соединения с 5-фторурацилом. Структура продукта была подтверждена методами ЯМР ¹H, ¹³C, ИК-спектроскопии и масс-спектрометрии. Были определены температура разжижения, выход реакции, растворимость полученного продукта, а также изучена биологическая активность на 3 типах раковых клеток: HeLa (рак шейки матки), HT-29 (рак толстой кишки) и MCF-7 (рак молочной железы).

ABSTRACT

In this study, a new compound was synthesized by the reaction of the chloroacetylation product of 3-ethyl aniline with 5-fluorouracil. The process was carried out in 2 steps, first the chloroacetylation reaction of 3-ethyl aniline was performed, and then the new product was synthesized based on the reaction of the obtained compound with 5-fluorouracil. The structure of the product was confirmed using ¹H, ¹³C NMR, IR and Mass spectrometry methods. The liquefaction temperature, reaction yield, solubility of the obtained product were determined and the biological activity was studied in 3 types of cancer cells: HeLa (cervical), HT-29 (colon) and MCF-7 (breast cancer cells).

Ключевые слова: 5-Фторурацил (5-Фу), хлорацетилхлорид, 3-этиланилин.

Keywords: 5-Fluorouracil (5-Fu), chloracetyl chloride, 3-ethyl aniline.

Введение. Рак — одно из самых опасных для жизни заболеваний в мире, представляющее серьезную угрозу для здоровья и жизненной силы человека [1]. Хирургическое вмешательство, лучевая терапия, химиотерапия и биологическая иммунизация являются основными стратегиями лечения, среди которых химиотерапия играет важную роль в лечении рака [2]. 5-Фторурацил (5-Фу) был впервые синтезирован в 1957 году и является одним из противораковых агентов, обычно используемых для лечения таких опухолей, как рак толстой кишки, желудка и молочной железы [3]. Из-за отсутствия селективности в отношении раковых клеток терапевтическое применение 5- Фу вызывает серьезные повреждения костного мозга, желудочно-кишечного тракта, дерматит, диарею и центральной нервной системы. Для уменьшения этих побочных эффектов были проведены многочисленные модификации структуры 5- Фу, и на основе его модификаций аминокислотами, пептидами, фосфолипидами и полимерами был синтезирован ряд лекарственных препаратов [4].

Было разработано несколько низкомолекулярных производных 5-фторурацила, таких как 5-фторурацил-2'-дезоксиуридин, 1-(2-тетрагидрофурил)-5-фторурацил и 3,5-диоктаноил-5-фтор-2-дезоксиуридин [5-6]. Было показано, что N¹- и N³-замещенные производные 5-фторурацила обладают улучшенными фармакологическими и фармакокинетическими свойствами. К ним относятся высокая биологическая активность, селективность, метаболическая стабильность, хорошая биодоступность и более низкая токсичность. Например, шесть новых производных 5-фторурацила были синтезированы с помощью реакций N¹- и N³-замещения, и их структуры были подтверждены с помощью ЯМР 1H и 13C, масс-спектрометрии и элементного анализа [7]. Кроме того, α-токоферол является наиболее активным компонентом природного витамина Е, и на его основе было синтезировано новое pH-чувствительное соединение α-токоферол-5-Фу [8].

В дополнение к вышеупомянутой работе Артур Яблонский синтезировал четыре производных симантрена, содержащих 5-фторурацил; все соединения были охарактеризованы спектроскопическими методами, а кристаллическая структура двух производных была подтверждена рентгеноструктурным анализом.

Для получения продуктов на основе симантрена, прежде всего, 3-хлорпропионилсимантрен реагировал с 5-Фу в растворителе ДМФА под катализом триэтиламина с образованием соединения, содержащего кетонную группу, с выходом 67%. На следующем этапе карбонильная группа в соединении восстанавливалась тетрагидроборатом натрия в растворителе тетрагидрофуране при комнатной температуре и превращалась в спиртовую форму. Структуры всех полученных продуктов были подтверждены ЯМР 1H и 13C, масс-спектрометрией, ИК-спектроскопией и элементным анализом [9]. В продолжение этой работы, в 2003 году американские ученые впервые синтезировали новое производное диазенумдиолата 5-Фу с целью повышения его чувствительности и эффективности против опухолевых заболеваний и получения безопасных лекарственных препаратов [10]. У пациентов, получавших лечение 5-фторурацилом (5-Фу), были зарегистрированы некоторые побочные эффекты, и для преодоления этих проблем были внесены многочисленные модификации в структуру 5- Фу. В данной работе были изучены реакции продукта хлорацетилирования 3-этиланилина с 5-фторурацилом, а его структура была подтверждена с помощью методов ЯМР 1H, 13C, ИК-спектроскопии и масс-спектрометрии. Кроме того, были определены температура разжижения, выход реакции, растворимость полученного продукта, а также исследовано его биологическое действие на 3 типа раковых клеток: HeLa (рак шейки матки), HT-29 (рак толстой кишки) и MCF-7 (рак молочной железы).

Экспериментальная часть

Для измерения температуры ликвидуса полученного продукта использовался прибор M-560. Спектры ЯМР ¹H и ¹³C были получены в растворителе ДМСО на спектрометрах VARIAN MR 400 МГц. Масс-спектрометрический анализ проводился с использованием масс-спектрометра высокого разрешения (HRMS) AB SCIEX QSTAR Elite. ИК-спектры измерялись с использованием KBr на приборе ATR Bruker Invenio S-2021 4000‒400 см^–1.

Результаты исследований и обсуждения

Метод синтеза

Синтез нового производного 5-фторурацила (5-Фу) на основе 3-этиланилина проводился в два этапа. На первом этапе для получения N-хлорацильного продукта 3-этиланилина сначала в круглодонной колбе объемом 100 мл растворяли ароматический амин (0,01 моль) в ацетонитриле, добавляли соль K₂CO₃ (0,01 моль, 1,38 г), и после понижения температуры до -1-3°C по каплям добавляли хлорацилхлорид (0,01 моль, 0,8 мл) при перемешивании магнитной мешалкой в ​​течение 30 минут. Затем смесь оставляли в ультразвуковом аппарате на 2 часа, после чего проводили анализ с помощью ТСХ (гексан:ацетон, 1,5), а затем очищали и сушили.

Схема-1

На втором этапе реакции 5-фторурацил (5- Фу) (0,000625 моль, 0,081 г) растворяли в 2 мл ДМФА при комнатной температуре и добавляли K₂CO₃ (0,00125 моль, 0,1725 г). Затем при перемешивании добавляли полученный 3-этил-N-хлорацетиланилин (0,00125 моль), и реакцию проводили в течение 10-12 часов в ультразвуковой водяной бане при комнатной температуре. Реакционную смесь проверяли и очищали каждые два часа с помощью ТСХ (гексан:ацетон, 1-1,5).

Схема-2

Рисунок 1. 2,2'-(5-фтор-2,4-диоксопиримидин-1,3(2H,4H)-диил)бис(N-(3-этилфенил)ацетамид)

Структура продукта была определена с помощью ИК-спектроскопии, спектроскопии ЯМР 1H, 13C и масс-спектрометрии.

Рисунок 2. ИК-спектр 2,2'-(5-фтор-2,4-диоксопиримидин-1,3(2H,4H)-диил)бис(N-(3-этилфенил)ацетамида)

Рисунок 3. Масс-спектр 2,2'-(5-фтор-2,4-диоксопиримидин-1,3(2H,4H)-диил)бис(N-(3-этилфенил)ацетамида)

Рисунок 4. Н ЯМР-спектр 2,2'-(5-фтор-2,4-диоксопиримидин-1,3(2H,4H)-диил)бис(N-(3-этилфенил)ацетамида)

Рисунок 5.^. C ЯМР-спектр 2,2'-(5-фтор-2,4-диоксопиримидин-1,3(2H,4H)-диил)бис(N-(3-этилфенил)ацетамида)

Выход продукта: 72,5%. Температура плавления 210-212°C. Rf = 0,79 (гексан:ацетон – 2:3). ИК-спектр (гранулы KBr): ν=3329 (NH), 2965 (Ar-H), 1715 (-C=O, amid),1654, 1615 (-C=O, 5-Fu), 1449 (CH2-C=O), 1019 (C-F) cm-1. ESI-MS m/z 451.18 [M - H]^- по формуле (C₂₄H₂₅FN₄O₄)= 452.17. 1H ЯМР-спектр (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.29 (s, 1H), 10.27 (s, 1H), 8.29 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 7.47 (s, 1H), 7.44 (s, 1H), 7.34 (t, J = 8.9 Hz, 1H), 7.23 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.91 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 4.64 (s, 1H), 4.60 (s, 1H), 3.34 (s, 2H), 2.56 (dd, J = 7.6, 4.0 Hz, 2H), 1.17 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 1.16 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 1.14 (d, J = 2.0 Hz, 2H). 13C ЯМР-спектр (101 MHz, DMSO-d6) δ 164.94, 164.46, 156.71, 156.45, 149.74, 144.47, 144.40, 139.77, 138.64, 138.50, 137.51, 130.58, 130.25, 128.77, 128.70, 123.15, 122.97, 118.39, 116.48, 116.42, 51.03, 43.85, 28.23, 15.48.

Биологическая активность

Колориметрический метод количественного определения клеточной выживаемости и пролиферации МТТ основан на расщеплении МТТ (соли тетразолия: 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2н-тетразолиум бромид) митохондриальным ферментом сукцинат дегидрогеназой живых клеток с образованием продукта – голубого формазана, который кристаллизуется внутри клетки. Перевод формазана в раствор с помощью органического растворителя (диметилсульфоксида или изопропилового спирта) и последующая фотометрия (500-700 нм) позволяют сопоставить изменения оптической плотности раствора по отношению к контролю с изменением количества жизнеспособных клеток, а в цитотоксических исследованиях оценивать специфическую гибель клеток, индуцированную тем или иным цитотоксическим агентом.

Подсчитывали количество живых клеток по 25000 клеток в лунку, разбавляя соответствующей питательной средой и раскапывая по 100 мкл в лунки 96-луночных планшетов (COSTAR, США). Клетки оставляли на сутки в СO₂-инкубаторе, после чего культуральную среду заменяли новой порцией среды. Далее вносили исследуемые вещества в различных концентрациях, а также препараты сравнения (вещества с заведомо известным действием). Клетки вновь оставляли на сутки в СO₂-инкубаторе. На следующий день в лунки вносили по 20 мкл МТТ (SIGMA, США), предварительно растворенного в PBS до концентрации 5 мг/мл. Клетки оставляли на 4 часа в CO₂ инкубаторе при 37°С. По истечении срока инкубации из лунок удаляли среду, после чего в каждую лунку вносили по 100 мкл DMSO (SIGMA, США). Через 10 минут снимали показания на спектрофотометре при длине волны 620 нм.

Анализ и статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы «OriginPro 8.6». Достоверными считали результаты при р≤0,05.

При изучении биологической активности 2,2'-(5-фтор-2,4-диоксопиримидин-1,3(2H,4H)-диил)бис(N-(3-этилфенил)ацетамида) на 3 различных типах раковых клеток (50 ммоль/л) было установлено, что степень ингибирования роста клеток Hela (клетки рака шейки матки) составила 82,35% (5-Фу=27,08%), степень ингибирования клеток HT-29 (клетки рака толстой кишки) — 72,09% (5-Фу =40,75%), а степень ингибирования клеток MCF-7 (клетки рака молочной железы) — 70,28%, в то время как 5-Фу составил 41,49%.

Заключение.

Впервые синтезирован 2,2'-(5-фтор-2,4-диоксопиримидин-1,3(2H,4H)-диил)бис(N-(3-(этилфенил)ацетамид) и подтверждена его химическая структура с помощью ИК-спектроскопии, ЯМР-спектроскопии ¹H и ¹³C, а также масс-спектрометрии. При изучении биологической активности полученного соединения по его ингибирующим свойствам в отношении клеток Hela (клетки рака шейки матки), HT-29 (клетки рака толстой кишки) и MCF-7 (клетки рака молочной железы) было показано, что ингибирующее действие полученного вещества на клетки Hela в 3 раза сильнее, чем у 5-фторурацила, и почти в 2 раза активнее, чем 5-фторурацил, в отношении клеток HT-29 и MCF-7.

Список литературы:

1. Sarkar F. H. Part I. Recent trends in anti-cancer drug discovery //Mini reviews in medicinal chemistry. – 2010. – Т. 10. – №. 5. – С. 357-358.
2. Dang C. T. Drug treatments for adjuvant chemotherapy in breast cancer: recent trials and future directions //Expert review of anticancer therapy. – 2006. – Т. 6. – №. 3. – С. 427-436.
3. Cunningham D., James R. D. Integrating the oral fluoropyrimidines into the management of advanced colorectal cancer //European Journal of Cancer. – 2001. – Т. 37. – №. 7. – С. 826-834.
4. Zhang F. M. et al. Synthesis and biological evaluation of new 4β-5-Fu-substituted 4'-demethylepipodophyllotoxin derivatives //Molecules. – 2006. – Т. 11. – №. 11. – С. 849-857.
5. Malet-Martino M., Martino R. Clinical studies of three oral prodrugs of 5-fluorouracil (capecitabine, UFT, S-1): a review //The oncologist. – 2002. – Т. 7. – №. 4. – С. 288-323.
6. Wang J. X., Sun X., Zhang Z. R. Enhanced brain targeting by synthesis of 3′, 5′-dioctanoyl-5-fluoro-2′-deoxyuridine and incorporation into solid lipid nanoparticles //European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. – 2002. – Т. 54. – №. 3. – С. 285-290.
7. Tian Z. Y., Du G. J., Xie S. Q., Zhao J., Gao W.Y., and Wang Ch. J.  Synthesis and bioevaluation of 5-fluorouracil derivatives //Molecules. – 2007. – Т. 12. – №. 11. – С. 2450-2457.
8. Li D. W., Tian F.F., Ge Y.Sh., Ding X.L.,J.H.Li, Xu Z.Q., Zhang M.F., Han X.L., Li R., Jianga F. L. and Liu Y. A novel pH-sensitive (±)-α-tocopherol–5-fluorouracil adduct with antioxidant and anticancer properties //Chemical Communications. – 2011. – Т. 47. – №. 38. – С. 10713-10715.
9. Jablonski A., Matczak K., Koceva-Chyła A., Durka K., Steverding D., Jakubiec-Krzesniak K., Solecka J., Trzybinski D.,Wozniak K., Andreu V., Mendoza G., Arruebo M., Kochel K., Krawczyk B.,  Szczukocki D.,  and Kowalski K. Cymantrenyl-nucleobases: Synthesis, anticancer, antitrypanosomal and antimicrobial activity studies //Molecules. – 2017. – Т. 22. – №. 12. – С. 2220.
10. Cai T. B., Tang X., Nagorski J., Brauschweigerb P.G. and Wanga P.G. Synthesis and cytotoxicity of 5-fluorouracil/diazeniumdiolate conjugates //Bioorganic & medicinal chemistry. – 2003. – Т. 11. – №. 23. – С. 4971-4975.